干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。骨髓间质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)属于成体干细胞的一种，同时也是一种多能干细胞。近年来研究发现，MSC具有多向分化潜能，适当的条件下，可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、肝细胞、心肌细胞、神经细胞[1-7]等。而且MSC易于分离获得，便于体外培养扩增，易于外源基因的转染和表达，在组织工程和基因治疗等方面具有非常广阔的应用前景[8]。体外研究MSC定向诱导分化为神经细胞的条件，建立MSC的分化模型，进一步分析MSC在分化过程中的基因表达变化，不仅有助于研究MSC向神经细胞分化的调控机制，也对阐明老年性痴呆、帕金森病等的发病机制及临床治疗具有重要意义。 目前MSC神经的研究热点主要集中在优化体外诱导体系。将MSC作为转基因的载体细胞来研究细胞分化的机制的报道尚不多。Sox基因家族在HMG-box区是高度保守的，是神经发育时期的重要的调控因子。本研究主要探索了在中药诱导大鼠骨髓间充质细胞(ratmesenchymalstemcells，rMSC)神经分化过程中的同源盒基因Sox1的表达差异，以及复制缺陷型逆转录病毒介导Sox1基因过表达于rMSC后促进rMSC向神经细胞分化。 本实验包括以下两个部分：1.rMSC的定向神经分化和Sox1基因的表达检测 1.1rMSC的分离和培养扩增利用rMSC在体外具有较强的贴壁生长的特性，取4周SD大鼠的骨髓培养，5-7d长梭形的rMSC80％-90％汇合，传代去除骨髓间充质之外的杂细胞。培养10-12d，细胞形态均一，呈长梭形，并且排列呈一定的方向性，呈“漩涡样”生长。 1.2黄芪定向诱导rMSC分化为神经元样细胞实验组加入诱导液黄芪注射液诱导1h后，细胞形态即明显发生变化，大多数细胞均转变为神经元样细胞形态，细胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，伸出突起(轴突)，轴突的末端出现一级和二级分叉，类似树突，部分细胞之间拉成网状。在黄芪注射液诱导1h后，将细胞固定，进行神经元标志物染色。免疫组化结果显示：95.7％±2.3％rMSC的神经干细胞标志物Nestin和神经元标志物NSE表达阳性，神经胶质细胞标志物GFAP表达阴性。 1.3免疫组化法检测神经样细胞Sox1蛋白质表达免疫组化结果显示：大部分黄芪诱导细胞的细胞体和突触皆呈棕黄色表现为Sox1染色为阳性，，对照组无阳性细胞出现。说明94.3％±2.5％rMSC分化为神经元样细胞时表达Sox1转录因子，对照组则不表达该转录因子。 2.pLXSN-Sox1重组逆转录病毒液感染后rMSC中Sox1蛋白的表达检测和向神经细胞分化的鉴定 2.1pLXSN-Sox1重组质粒的制备和鉴定利用亚克隆技术构建pLXSN-Sox1逆转录病毒载体。重组pLXSN-Sox1质粒经EcoRⅠ+XhoⅠ酶切鉴定，酶切反应产物符合预期的酶切图谱。重组质粒测序与基因bank中Sox1序列进行比对，证实重组质粒插入片段为Sox1基因。 2.2重组逆转录病毒质粒包装与大量扩增：将重组逆转录病毒质粒pLXSN-Sox1和平行对照pLEGFP-N1质粒(表达EGFP报告基因)利用脂质体法转染细胞PT67，收集含病毒的培养基。取少量原代包装病毒再感染PT67细胞进行病毒大量扩增。 2.3pLXSN-Sox1重组逆转录病毒PCR鉴定将重组逆转录病毒感染rMSC3d后取rMSC基因组用作PCR模板，用目的基因引物片段进行PCR扩增。证明包装病毒为带有目的基因Sox1的重组逆转录病毒pLXSN-Sox1。 2.4逆转录病毒的病毒感染率测定通过倍比终点稀释法在荧光显微镜下观察rMSC感染后的绿色荧光的表达来测定平行对照pLEGFP-N1质粒病毒感染率，结果显示其在稀释度小于104时，感染效率可达到38.4％±2.3％。作为对照，用pLEGFP-N1质粒脂质体法转染rMSC，结果发现脂质体法转染rMSC效率很低，仅为2.1％±0.8％。并以此结果推测实验组pLXSN-Sox1重组逆转录病毒的感染率。 2.5重组逆转录病毒液感染rMSC后细胞Sox1蛋白表达的检测将传代至5-9代的rMSC分为三个实验组：分别为pLXSN-Sox1感染组，pLEGFP-N1平行对照空载体组以及未感染病毒组。免疫细胞化学结果显示：在pLXSN-Sox1病毒液中处理48h后，94.5％±3.5％rMSC细胞感染pLXSN-Sox1病毒液后表达Sox1转录因子，空载体病毒液感染和未感染组无阳性细胞出现。各组细胞的蛋白提取后进行SDS聚丙烯酰胺电泳，电转膜至硝化纤维膜，用小鼠的多克隆抗体Sox1进行Western-blotting检测显示：Sox1感染组细胞裂解蛋白出现一条特异性蛋白带(39.5kDa)，而对照组和空载体感染组未有蛋白带显示，表明Sox1基因在逆转录病毒介导下能在rMSC中瞬时高效表达Sox1蛋白。 2.6过表达重组逆转录病毒pLXSN-Sox1对rMSC分化为神经样细胞的影响rMSC在pLXSN-Sox1病毒液中处理48h后，细胞形态发生明显变化，rMSC的细胞质向核收缩，呈典型的核周体形态，其中约5％细胞转变为神经元细胞样形态，伸出突起(轴突)，轴突的末端出现一级分叉，类似树突，部分细胞之间拉成网状。空载体病毒液感染组和未感染组细胞形态没有上述改变。免疫细胞化学结果显示，Nestin、NSE在感染病毒液前为阴性，感染病毒液后93.4％±2.3％rMSC的细胞体和突触皆为阳性。 结论1.在黄芪诱导rMSC神经分化的过程中，证实Sox1同源盒基因被激活。说明Sox1转录因子参与了rMSC神经分化的过程。 2.分子亚克隆技术构建逆转录病毒重组载体pLXSN-Sox1，阳性脂质体介导pLXSN-Sox1载体转染至包装细胞PT67，获得Sox1重组包装逆转录病毒。收获病毒液，用带EGFP表达盒逆转录病毒系统作为平行对照判断病毒液的感染和表达率。说明逆转录病毒是有效的介导rMSC基因转移的载体。 3.pLXSN-Sox1重组逆转录病毒液感染rMSC后，rMSC表达Sox1蛋白，并表达神经元标志。说明Sox1基因在诱导神经分化过程中的始动作用。