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[目 的]1、第一部分大鼠脑梗死模型制备的优化及大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的构建。2、第二部分研究HSP70-hom+2437 SNPs在SD大鼠MCAO模型中的作用,并进一步探究其作用机制。[方 法]1、第一部分(1)大鼠MCAO模型的制备:将50只体重在260-280g雄性SD大鼠(SPF级)分为两组,分别为假手术组和模型组,每组各25只。模型组大鼠全部予以线栓法制备大鼠右侧大脑中动脉阻塞,阻断大脑中动脉的血流,形成永久性MCAO模型。假手术组不放置栓线、不结扎血管,余步骤相同。(2)神经功能缺损评分及TTC染色测脑梗死体积:MCAO模型制作后24h,采用Bederson法进行神经功能评分。评分后立即处死大鼠取脑组织,并将脑组织切为厚度为2mm薄片行TTC染色,分析各组大鼠脑梗死体积百分比。(3)HE染色观察组织细胞形态学改变:取各组大鼠第3片脑切片固定3d后行石蜡包埋切片,包埋好的石蜡切片进行脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水封片后于尼康倒置荧光显微镜下观察细胞形态学改变并采集图像分析。2、第二部分(1)构建慢病毒:构建阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒,采用有限稀释法测定上述慢病毒滴度。测定荧光感染效率为60%时,两组过表达慢病毒最佳滴度为(1E+5)×60%/(1E-1)=6E+5,单位为TU/μl,6E+8TU/ml。(2)侧脑室定位注射:将150只210-230g重雄性SD大鼠随机分为五组,分别为MCAO模型组、MCAO模型+生理盐水组、MCAO模型+阴性病毒对照组、MCAO模型+过表达C等位基因组、MCAO模型+过表达T等位基因组,每组各30只。单纯MCAO模型组不进行侧脑室注射;MCAO模型+生理盐水组、MCAO模型+阴性病毒对照组、MCAO模型+过表达C等位基因组、MCAO模型+过表达T等位基因组,分别注射生理盐水、阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒。(3)侧脑室定位注射后,饲养大鼠至体重260-280g,构建大鼠MCAO模型,24h后对各组的神经功能损伤进行评分,采用TTC染色法测量各组脑梗死面积、HE染色法观察各组组织形态学的改变。(4)提取缺血半暗带脑组织总RNA及总蛋白后分析HSPA1L和凋亡相关因子的相对表达情况:采用qPCR与Western blot法测各组大鼠脑梗死周边区HSPA1L、促凋亡因子Bax与cleaved-caspase3、抑凋亡因子Bcl-2的mRNA及蛋白表达情况。[结 果]1.第一部分(1)验证大鼠MCAO模型的成功性:相对于假手术组,在模型组中出现了明显的神经功能损伤的症状,且模型组神经功能缺损评分明显增高,差异具有统计学意义(P<0.001)。(2)TTC染色验证梗死的部位和体积,TTC染色中梗死部位常位于皮质及皮质下区,模型组出现明显的梗死区,与正常组对比差异具有明显统计学意义(P<0.05)。(3)HE染色验证细胞水平的病理改变。实验结果显示,在模型组的梗死核心区神经细胞大多数坏死,而缺血半暗带中神经元多出现凋亡,进一步验证了脑梗模型的成功。2.第二部分(1)成功构建并转染过表达HSP70-hom+2437C、T等位基因慢病毒:实验中构建阴性对照病毒,过表达C等位基因慢病毒、过表达T等位基因慢病毒,并将其转染大鼠脑组织。qPCR、Western blot检测过表达C等位基因、T等位基因在脑组织内的表达情况:模型组、生理盐水组和阴性对照病毒之间HSP70-hom mRNA及HSPA1L蛋白水平无明显差异。而与模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组相比,过表达C和T等位基因组HSP70-hom mRNA及HSPA1L蛋白含量均增高,差异具有统计学意义(p<0.05),而C、T等位基因组之间mRNA和蛋白水平的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)神经功能缺损评分:大鼠MCAO模型24h后,模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组神经功能缺损评分未见明显差异(P>0.05),与模型组、生理盐水组和阴性对照病毒组相比,过表达C、T等位基因组能明显降低神经功能缺损评分,差异具有统计学意义(P<0.01)。过表达C等位基因组与过表达T等位基因组两组间神经功能缺损评分无明显差异(P>0.05)。(3)TTC染色测梗死面积:各组大鼠MCAO模型24h后脑梗死体积百分比分别为43.28%、43.62%、42.52%、35.60%、30.81%,前三组脑梗死体积无统计学差异(P>0.05),与前三组相比,转染过表达C、T等位基因后梗死体积缩小,差异具有统计学意义(P<0.05),且过表达T等位基因组梗死体积比过表达C等位基因组减小更明显(P<0.05)。(4)HE染色观察组织形态学出现的病理改变:过表达C、T等位基因组缺血半暗带神经元胞膜皱缩染色加深、核固缩溶解及碎裂等形态学改变均较前三组减轻、神经元密度明显增高。(5)qPCR、Western blot测定HSPA1L、凋亡相关因子在脑组织内的表达情况:①qPCR实验中与模型组、生理盐水组、阴性对照病毒组相比,转染过表达C、T等位基因后促凋亡因子Bax的mRNA表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);过表达C、T等位基因两组间差异无统计学意义(P>0.05)。②蛋白检测实验中,与模型组、生理盐水组、阴性对照病毒组相比,转染过表达C、T等位基因后促凋亡蛋白Bax的表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与过表达C等位基因组相比,过表达T等位基因组Bax蛋白的降低更明显(P<0.05)。而Bcl-2、cleaved-caspase3 mRNA及蛋白的表达在五组间无明显差异(P>0.05)。[结论]第一部分:1、成功构建大鼠MCAO模型并验证模型制备成功;2、成功从术前准备、术中操作、术后护理各方面对大鼠MCAO模型的构建进行了改良,提高了大鼠MCAO模型的存活率及成模率。第二部分:1、转染过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因降低MCAO大鼠模型神经功能损伤评分、减轻缺血半暗带病理变化、减小梗死体积,且过表达T等位基因的上述作用较过表达C等位基因组更为明显。2.转染过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因可降低大鼠脑组织内促凋亡因子Bax的表达,且在过表达HSP70-hom+2437 T等位基因组中降低更为明显,提示过表达HSP70-hom+2437 C、T等位基因可能通过下调Bax表达来发挥对大鼠MCAO模型的保护作用。