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垂体腺瘤是良性肿瘤,但约1/3的肿瘤侵入海绵窦、蝶窦及斜坡等,称之为侵袭性垂体腺瘤。除了垂体泌乳素腺瘤对溴隐亭治疗敏感外,大多数垂体腺瘤的治疗有赖于手术切除及术后放疗。垂体腺瘤侵袭周围组织造成手术全切除困难、术后易于复发等。垂体肿瘤的侵袭转移是一个复杂的过程,涉及基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂、多种细胞因子等。膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP,MMP-14)是基质金属蛋白酶家族的重要成员,它能降解细胞外基质(ECM)和基底膜,与基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)在维持细胞基底膜完整性中共同发挥重要作用。因此,本文研究MT1-MMP(MMP-14)在侵袭性垂体腺瘤中作用的可能机制,以期由此干预垂体腺瘤的侵袭行为。第一部分侵袭性垂体腺瘤的评估目的 建立侵袭性垂体腺瘤(IPA)评估标准,获取IPA组织标本库。方法 1.Hardy分级、分期法评估MRI垂体腺瘤的蝶窦侵袭,Knosp分类法评估MRI垂体腺瘤的海绵窦侵袭;2.根据MRI表现,将125例垂体腺瘤患者分为IPA 58例及非侵袭性垂体腺瘤(NIPA)67例,以术中所见为依据,分析MRI判断IPA的敏感性(Sen)、特异度(Spe)、阳性预测值(PPV)及阴性预测值(NPV);3.分析IPA的临床特点。结果 1.MRI上分析垂体腺瘤侵袭蝶窦的敏感性为85.3%、阳性预测值为82.9%;Knosp0~Ⅰ级的垂体腺瘤,手术证实均为NIPA,Sen及NPV均为100%,KnospⅢ级~Ⅳ级的垂体腺瘤术中证实为IPA,Spe及PPV均为100%,NPV分别为93.8%及90.9%。2.IPA中大腺瘤及巨大腺瘤的发生率高、手术全切除率低、垂体卒中及复发的发生率高。3.功能性垂体腺瘤与无功能性垂体腺瘤中侵袭性的发生率接近,且功能性垂体腺瘤之间的IPA发生率无明显统计学差异。结论 Knosp分类法评估IPA的准确性高,术前MRI表现结合术中所见能更好的评估IPA。第二部分MT1-MMP(MMP-14)在侵袭性垂体腺瘤中的表达及意义目的 检测IPA组织中MT1-MMP(MMP-14)、VEGF、TGF-β、p53及PTTG的表达及相关性。方法 1.根据Knosp分类法,将82例垂体腺瘤患者分为IPA组37例、NIPA组45例,并将瘤周垂体组织3例作为对照组,运用实时定量PCR筛选IPA组织中MMPs(MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14、MMP-15)的基因表达谱,并检测VEGF、TGF-β、p53及PTTG m RNA表达水平。2.运用免疫组化检测MT1-MMP(MMP-14)及MMP-2在IPA组织中蛋白表达水平。3.将小鼠垂体腺瘤At T-20细胞进行传代培养,同样应用real-time PCR检测At T-20细胞中MMPs、VEGF、TGF-β、p53以及PTTG m RNA的表达,并与正常小鼠垂体组织进行对照,进一步验证MT1-MMP(MMP-14)与其他因子的相关性。结果 1.MMPs基因表达谱及相关因子表达:IPA组织中MMP-1、2、9,MT1-MMP(MMP-14)m RNA的表达水平高于NIPA及瘤周垂体组织,且MT1-MMP(MMP-14)m RNA表达水平明显增高(P<0.001),但MMP-15 m RNA无明显改变(P>0.05);VEGF、TGF-β以及PTTG m RNA在IPA组织中也高于其他两组(P<0.001),但p53 m RNA无明显改变(P>0.05)。MT1-MMP(MMP-14)与VEGF、TGF-β、PTTG及MMP-1、2、9呈正相关(P<0.05),而与MMP-15及p53不相关(P>0.05)。2.免疫组化结果:IPA组织中MT1-MMP(MMP-14)、MMP-2的表达高于NIPA组,染色结果显示MT1-MMP(MMP-14)主要位于细胞膜上;MMP-2主要表达于细胞基质及胞浆内。3.验证MT1-MMP(MMP-14)与其他因子表达的相关性:At T-20细胞中MT1-MMP(MMP-14)、VEGF、TGF-β以及PTTG m RNA的表达水平呈正相关,且高于对照组(p<0.001),而MMP-2、MMP-9、MMP-15及p53 m RNA无明显改变(p>0.05),进一步验证了MT1-MMP(MMP-14)参与垂体腺瘤侵袭过程的可能性。结论 MT1-MMP(MMP-14)在IPA中高表达,且与VEGF、TGF-β及PTTG m RNA呈正相关,提示MT1-MMP(MMP-14)在垂体腺瘤侵袭及血管生成过程中有着重要作用。第三部分干扰MT1-MMP(MMP-14)对小鼠垂体腺瘤侵袭行为的影响目的 构建MT1-MMP(MMP-14)干扰载体,瞬时转染At T-20细胞,探讨MT1-MMP(MMP-14)在小鼠垂体腺瘤侵袭过程中的作用及可能机制。方法 1.MT1-MMP(MMP-14)高效si RNA表达载体的构建及转染:依据干扰载体设计原则选取四条可能的序列作为目标序列(MMP14-mus-1050、1246、1358 and 537),将目的片段构建p GPU6/GFP/Neo-MMP-14干扰载体;并将构建的p GPU6/GFP/Neo-MMP-14四个不同si RNA表达载体用脂质体瞬时转染至小鼠垂体腺瘤At T-20细胞。通过real-time PCR筛选出效率最高的干扰载体;48h后通过荧光显微镜进一步检测其转染效率。2.MT1-MMP(MMP-14)基因沉默:运用real-time PCR检测MT1-MMP(MMP-14)高效si RNA表达载体对At T-20细胞中MMPs(MMP-2、9、15)、VEGF、TGF-β、p53及PTTG m RNA表达水平的影响。3.TIMP-1处理At T-20细胞对MMPs、血管因子及与肿瘤相关因子m RNA及蛋白表达水平的影响:将培养状态良好的At T-20细胞分为三组①对照组:条件培养基;②处理组A:条件培养基+10μmol/m L TIMP-1蛋白;③处理组B:条件培养基+50μmol/m L TIMP-1蛋白。Real-time PCR检测不同浓度TIMP-1蛋白处理At T-20细胞对MMPs、血管因子及与肿瘤相关因子m RNA表达水平;Western blot检测不同浓度的TIMP-1对MT1-MMP(MMP-14)及MMP-2表达的影响。4.TIMP-1蛋白处理At T-20细胞后侵袭能力的改变:在At T-20细胞中分别加入10μmol/m L及50μmol/m L TIMP-1,利用At T-20细胞穿过Matrigel胶的数目,判断不同浓度TIMP-1对At T-20细胞侵袭能力的影响。结果 1.成功构建MT1-MMP(MMP-14)si RNA表达载体:Real-time PCR检测四种干扰载体MMP14-mus-1050、1246、1358及537,并与对照组比较,其m RNA表达受到四个载体不同程度的抑制,其中MMP14-mus-1246组的抑制效率最为明显,且p GPU6/GFP/Neo-si T1-1246细胞的绿色荧光蛋白表达率达到70%以上;重复实验后,选择该组高效干扰表达载体用于下一步实验。2.构建瞬时沉默细胞模型:MT1-MMP(MMP-14)-si RNA表达载体瞬时转染入At T-20细胞,real-time PCR结果显示:干扰组PTTG、VEGF、TGF-β、MMP-9 m RNA表达明显降低,而MMP-2、MMP-15及p53改变不明显;3.TIMP-1蛋白处理At T-20细胞:高浓度TIMP-1可以明显降低At T-20细胞中MT1-MMP(MMP-14)m RNA表达,同时VEGF、TGF-β及PTTG m RNA表达下调。Western blot结果显示:低浓度TIMP-1可以抑制MT1-MMP(MMP-14)蛋白表达,而MMP-2改变不明显;高浓度TIMP-1虽然可以抑制MMP-2,但对MT1-MMP(MMP-14)抑制效果更好。4.TIMP-1蛋白处理At T-20细胞后侵袭能力的改变:At T-20细胞经TIMP-1蛋白处理后,随着TIMP-1浓度增加且时间延长其侵袭能力明显下降。高浓度TIMP-1可以使MT1-MMP(MMP-14)下调从而影响其侵袭、迁移能力。结论 MT1-MMP(MMP-14)参与调控PTTG及VEGF,在垂体腺瘤侵袭中发挥重要作用。TIMPs可以抑制MT1-MMP(MMP-14)对PTTG及VEGF的调控,因而MT1-MMP有可能成为治疗侵袭性垂体腺瘤的潜在分子靶点。