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【背景】前列腺癌是全世界男性癌症死亡的最常见的原因之一。很多器官局限性前列腺癌患者在行根治性前列腺切除术或局部放疗后肿瘤再次复发并进展。在分子水平上,雄激素激活雄激素受体(AR),作为核受体转录因子参与了特定致瘤基因的表达。因此,进展期的前列腺癌治疗主要以抑制雄激素的合成和拮抗AR的雄激素剥夺疗法为主。然而,大多数患者会对治疗产生耐药性,并随后发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),在大多数情况下,CRPC仍然依赖于AR信号通路。CRPC往往是致命的,故而改进对前列腺癌的治疗显得尤为迫切。AR如何调控CRPC生长并未完全阐释清楚,但肯定是通过特定的机制使AR能够在较低水平的雄激素下得以活化。组蛋白泛素化是表观遗传修饰的重要形式之一,参与调控基因转录、细胞周期和DNA损伤修复等事件。MYSM1是组蛋白H2A特异性去泛素化酶,其N端的JAMM结构域是金属酶共有的结构域,具有金属蛋白酶的水解活性,能够去除泛素分子。MYSM1的分子结构决定了它能够在胞核内去除泛素化的组蛋白,文献和课题组前期工作证实MYSM1对造血干细胞和多种免疫细胞的发育及功能十分重要。虽然组蛋白泛素化修饰与肿瘤关系密切,但MYSM1在肿瘤中的作用尚无报道。研究表明,MYSM1参与了基因组稳定性的维持及细胞增殖过程,这提示MYSM1可能在肿瘤发生中扮演重要角色。为探明MYSM1对肿瘤的作用及其机制,本课题拟验证MYSM1与前列腺癌的相关性,明确其在前列腺癌发生中的作用,寻找并确定MYSM1的靶基因,探索MYSM1调控基因转录的分子机制,从而为前列腺癌的诊疗和预后判断提供潜在的靶点和标志物。【目的】探讨MYSM1在去势抵抗性前列腺癌中的生物学作用及其机制。【方法】1、利用公共数据库(The Human Protein Atlas)中相关结果明确MYSM1在前列腺癌中的表达情况;2、应用RNAi技术下调细胞内MYSM1的表达,通过qRT-PCR、Western blot对MYSM1表达水平进行鉴定;3、通过MTT实验检测下调MYSM1对去势抵抗性前列腺癌细胞增殖的影响;4、通过流式细胞仪分析下调MYSM1对去势抵抗性前列腺癌细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响;5、通过划痕实验检测下调MYSM1对去势抵抗性前列腺癌细胞迁移能力的影响;6、通过裸鼠皮下成瘤实验检测下调MYSM1对去势抵抗性前列腺癌细胞体内成瘤能力的影响;7、通过Co-IP方法证实MYSM1与AR的相互作用,通过ChIP方法进一步验证MYSM1的转录调控作用;8、通过Western blot法检测下调MYSM1对Akt/GSK-3β/C-Raf信号通路的影响。【结果】1、MYSM1在前列腺癌中表达降低。在公共数据库(The Human Protein Atlas)中查找并分析MYSM1在前列腺癌组织中的表达情况,发现相较于正常前列腺组织,MYSM1在前列腺癌中表达降低,其表达水平与前列腺癌的恶性程度成负相关。2、MYSM1稳定低表达细胞株及对照细胞株的建立。用MYSM1的干扰慢病毒感染去势抵抗性前列腺癌细胞(C4-2、22Rv1),应用嘌呤霉素持续筛选一周,于荧光显微镜下观察,发现视野内细胞绿色荧光皆为阳性;取筛选后的细胞,分别提取RNA及蛋白,通过qRT-PCR法检测MYSM1的mRNA水平,Western blot法检测MYSM1的蛋白表达水平,结果发现,与对照组相比,干扰慢病毒能够显著下调MYSM1的mRNA及蛋白表达水平。3、MYSM1能够明显抑制去势抵抗性前列腺癌细胞的生长。应用干扰慢病毒下调去势抵抗性前列腺癌细胞(C4-2、22Rv1)中MYSM1的表达,进行一系列体内外功能实验,结果发现:MTT实验证实,下调MYSM1能够显著促进前列腺癌细胞的生长;流式细胞仪周期检测结果显示,下调MYSM1使G1期细胞减少,促进细胞周期进展;裸鼠皮下成瘤实验显示,下调MYSM1能够显著促进前列腺癌细胞体内成瘤能力;流式细胞仪检测细胞凋亡及划痕实验显示,下调MYSM1对前列腺癌细胞凋亡及迁移能力并无显著影响。4、MYSM1能够与AR相互作用,通过影响AR信号通路介导前列腺癌的生长。有研究证实,MYSM1能够协调组蛋白的乙酰化与去泛素化进而参与基因的转录调控。通过分析TCGA数据库,我们发现MYSM1与AR的表达成正相关,但是,我们在细胞学水平证实,下调MYSM1并不影响AR的蛋白表达水平。下调MYSM1能够促进AR下游靶基因的表达,免疫共沉淀(Co-IP)实验证实,MYSM1与AR存在相互作用,染色质免疫共沉淀(ChIP)实验进一步证实,MYSM1能够调控雄激素反应元件(AREs)区域的染色质结构,从而影响AR信号通路相关分子的转录。5、MYSM1能够抑制Akt/GSK-3β/C-Raf信号通路,抑制前列腺癌的生长。雄激素作用的发挥既可以通过经典的雄激素受体介导的信号通路在核内转录调控雄激素反应元件;也可以经由雄激素受体非依赖的信号通路,通过活化PI3K/Akt信号通路从而参与肿瘤的生长。我们发现,MYSM1除了与AR直接结合影响经典信的AR信号通路外,对非经典的PI3K/Akt信号通路也有影响。下调MYSM1可以促进Akt、GSK-3β、C-Raf的磷酸化,同时,p53表达降低,c-Myc表达升高,激活Akt/GSK-3β/C-Raf信号通路,促进前列腺癌的生长。【结论】MYSM1作为一个重要的表观遗传分子,在前列腺癌的发生发展过程中发挥了重要作用,其作用的发挥可能有赖于其与AR的相互作用及其对AR信号通路的表观遗传学调控和对Akt/GSK-3β/C-Raf信号通路的活化。