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【背景】结直肠癌是世界范围内发病率和死亡率均高的恶性肿瘤，在我国位于消化系统肿瘤发病率的第三位。传统的肿瘤标志物CEA、CA199等敏感性较差，在早期患者中阳性率低，不利于结直肠癌的早期筛查。近年来随着基因组和蛋白质组研究技术的发展，一些有价值的分子标志物被陆续鉴定，但经大样本量临床验证并成功用于临床实践者仍然较少。因此，寻找和鉴定新的分子标志物并经临床研究得到验证和转化，将有助于结直肠癌的早期诊断、预后判断和治疗监测，对结直肠癌的诊疗意义重大。本实验室樊代明院士等在上世纪80年代采用结肠癌转移淋巴结分离的癌细胞匀浆免疫BALB/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术制备了一组抗结直肠癌单克隆抗体，命名为MC(colorectal monoclonal antibody)系列。其中，MC3Ab识别的抗原MC3-Ag在结直肠癌组织中的表达阳性率达90%以上，且其表达与TNM分期、有否转移密切相关，是结直肠癌灵敏度高、特异性强的候选生物标志物。本实验室前期对MC3-Ag在结直肠癌中的表达、临床诊断中的价值和作为靶标分子在治疗中的应用等方面进行了有意义的研究和探索，发表了多篇有影响的国际国内论文。但是MC3-Ag作为结直肠癌相关新抗原，一直未能得到鉴定，其编码基因尚不清楚。本研究应用蛋白质组学研究方法和技术成功分离和鉴定MC3-Ag，随后研究了其在结直肠癌中的表达和作为预后判断标志物的价值。功能学实验研究了MC3-Ag对于结直肠癌多种恶性生物学行为如无限增殖、凋亡抵抗和侵袭转移的影响，并对MC3-Ag的相互作用蛋白、下游分子事件和信号通路进行深入研究。【目的】1、分离和鉴定结直肠癌单克隆抗体MC3Ab所识别的抗原MC3-Ag2、明确MC3-Ag/Txl-2对于结直肠癌多种恶性生物学行为的调控3、研究MC3-Ag/Txl-2不同选择性剪接体在结直肠癌中的功能差异4、探讨MC3-Ag/Txl-2调控结直肠癌恶性生物学行为的分子机制【方法】1.采用蛋白质组学技术包括免疫沉淀、双向凝胶电泳(two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)分离和鉴定MC3-Ag，配对免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光/激光共聚焦和Western blot验证鉴定结果；组织芯片检测了MC3-Ag在正常组织和多种肿瘤组织中的表达谱。2.免疫组织化学研究MC3-Ag/Txl-2在243例结肠癌组织中的表达及其与临床病理参数间的关系，并获取随访资料进行单因素和多因素生存分析。构建Txl-2siRNA载体，稳定转染入高侵袭性结肠癌细胞SW620中并筛选获得Txl-2表达下调的细胞株。MTT实验、平板集落形成实验和流式细胞术检测细胞周期观察Txl-2对结肠癌细胞增殖能力的影响；Annexin V/PI凋亡染色研究Txl-2对细胞凋亡的影响；损伤刮擦实验、黏附实验、Transwell侵袭实验和软琼脂集落形成实验研究Txl-2对于结肠癌细胞迁移、黏附、侵袭和转移能力的影响。体内裸鼠成瘤和尾静脉转移实验验证体外实验结果。3.提取结肠癌组织、癌旁组织及正常组织mRNA,半定量RT-PCR检测Txl-2各选择性剪接体mRNA和总mRNA的表达情况。构建Txl-2各选择性剪接体Txl-2a、b和c的正义表达载体，稳定转染入无内源性Txl-2表达的结肠癌细胞系LoVo中，体外和体内功能实验分别观察Txl-2各亚型蛋白对无限增殖、凋亡抵抗和侵袭转移等恶性生物学行为的影响，研究它们的功能差异；对Txl-2b结构域关键催化位点进行位点特异性突变，研究介导恶性表型的关键结构域和特异性位点。4.利用酵母双杂交系统，通过AD载体和BD载体的共转染明确Txl-2各选择性剪接体与小G蛋白家族成员Ran的相互作用情况;免疫共沉淀实验进一步验证；间接免疫荧光/激光共聚焦观察Txl-2与Ran在结肠癌细胞和组织中的共定位情况。应用siRNAOligos、抗体和相关信号通路抑制剂等干预，Western blot检测相关分子和信号通路的改变。【结果】1．蛋白质组学研究鉴定并验证MC3Ab识别的抗原MC3-Ag是Txl-2蛋白应用结肠癌细胞裂解液和组织匀浆进行免疫沉淀，富集MC3-Ag，发现MC3Ab抗体识别30kDa左右的2个条带。免疫沉淀产物经2-DE后分别进行银染和Western blot鉴定，发现MC3抗体恒定识别分子量32kDa和28kDa、等电点pI~5的两个蛋白质点。将两个蛋白质点进行胶内酶解和MALDI-TOF-MS分析，得到相应的肽质量指纹图谱(peptide massfingerprinting, PMF)，经ProFound搜索引擎生物信息学分析，确认2个点是Thioredoxin like-2(Txl-2)蛋白的2个选择性剪接体(Swiss-Prot: Q86XW9-2和Q86XW9-3)。应用MC3Ab和anti-Txl-2Ab进行比对验证，配对免疫组织化学、免疫细胞化学发现两者染色模式一致；免疫荧光/激光共聚焦证实两个抗体染色的共定位；Western blot发现两个抗体能够在免疫沉淀产物和细胞裂解液中识别同样的条带,从而进一步证实MC3Ab识别的抗原MC3-Ag为Txl-2蛋白。组织芯片明确了MC3-Ag/Txl-2在多种肿瘤组织和正常组织中的表达谱。2.下调Txl-2的表达能够显著抑制结肠癌细胞的无限增殖、凋亡抵抗和侵袭转移等恶性表型MC3-Ag/Txl-2在243例结直肠癌组织中的免疫组化研究发现，MC3-Ag/Txl-2的表达与肿瘤分化程度呈显著负相关，随着TNM分期增高而表达水平逐渐增高，在转移性结直肠癌组织中高表达。单因素和多因素生存分析表明MC3-Ag/Txl-2是结直肠癌患者预后判断的独立指标，其表达量越高则预后越差。成功构建Txl-2siRNA载体，稳定转染入SW620细胞，获得表达抑制50%和70%以上的细胞株。功能学研究发现，下调Txl-2的表达能够显著抑制结肠癌细胞生长，平板集落形成能力减弱，细胞周期G0/G1期阻滞；抑制Txl-2的表达能够显著增加去血清或药物诱导的细胞凋亡比例；在高侵袭性细胞SW620中下调Txl-2的表达能够显著抑制结肠癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力。体内裸鼠成瘤实验和尾静脉转移实验进一步验证了体外实验结果。3. Txl-2的3个选择性剪接体差异调控结肠癌细胞恶性生物学行为在18例结肠癌组织、癌旁组织和正常组织中检测了Txl-2总mRNA和各选择性剪接体mRNA的表达情况，发现Txl-2总mRNA的表达水平在肿瘤组织中表达增高；在3个选择性剪接体中，Txl-2b和Txl-2c的mRNA在肿瘤中表达增高，而Txl-2a表达率较低（2/18例）。成功构建Txl-2各选择性剪接体的特异性正义表达载体，稳定转染入LoVo细胞中，获得稳定表达的细胞株。体内和体外功能实验表明，Txl-2的3种选择性剪接体差异调控结肠癌细胞恶性生物学行为：Txl-2b是发挥主要促癌作用的亚型，Txl-2a