【摘 要】
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目的类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是主要针对多种关节的慢性和系统性自身免疫性疾病,具有行为学未知,进行性残疾,全身性并发症,早期高死亡率和高社会经济成本等
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目的类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是主要针对多种关节的慢性和系统性自身免疫性疾病,具有行为学未知,进行性残疾,全身性并发症,早期高死亡率和高社会经济成本等特点。在这个疾病中,免疫系统的紊乱可能会导致慢性滑膜炎及血管翳形成,并接连造成滑膜、软骨和骨的损伤,以至于造成关节畸形和功能丧失,在这一过程中受刺激的免疫细胞产生了大量的细胞因子,其中的一部分可以诱发滑膜炎症,有的则可以通过对信号通路的激活促进金属基质蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)的分泌,造成关节骨和软骨不可逆的损伤。尽管已经发现了众多治疗这种异质性疾病的药物,但仍有约30%患者的疾病不能得到很好控制。miRNA(microRNA)是存在于细胞内的一类单链小分子RNA,已有很多报道显示,miRNA表达水平的失调是造成RA患者体内免疫系统信号传导通路和细胞因子表达水平紊乱的重要原因之一,在RA的发生发展进程中起到重要的作用。因此,在这个课题中,我们把miR-145-5p作为研究对象,旨在通过研究RA中miR-145-5p对IL-17的调控作用,进一步了解RA的发病机制,从而为RA的诊断、个性化治疗以及预后的判断提供重要线索和新的治疗靶点。方法本实验在RA-CD4+T细胞和成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synovial cells,FLS)两个细胞系中进行研究。检测RA-CD4+T细胞与T细胞其他亚群中miR-145-5p的表达量;在RA-CD4+T细胞中过表达miR-145-5p,根据实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)的结果确定转染效果;流式细胞仪检测过表达miR-145-5p后Th-17细胞的分化情况;Q-PCR检测过表达miR-145-5p后IL-17表达水平。在RA-FLS中,先在过表达miR-145-5p成功的前提下加入NF-κB,P53/MDM2,JNK及MAPK四条通路相应的通路抑制剂BAY11-7082,Nutlin-3,SP600125及SB203580,选取能够明显抑制MMPs表达的通路进一步探究;通过蛋白质印迹(Western blot)评估信号通路中关键调节因子蛋白表达量的变化;免疫荧光分析检测相应关键调节因子的核定位及活化情况;酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定 RA-FLS 培养基加入 IL-17 刺激后 MMPs 表达情况。结果1.RA-CD4+T细胞中miR-145-5p的表达水平高于T细胞其他亚群。2.RA-CD4+T细胞过表miR-145-5p后流式检测结果表明Th-17细胞分化比例增加,IL-17表达增多。3.四条通路分析中,只有加入核因子κB(NF-κB)信号传导通路的化学抑制剂BAY11-7082后显著减弱了 MMP-9的表达水平,未见其他通路的抑制剂对MMPs的表达有显著影响。4.过表达miR-145-5p后p-P65的水平显著增加,而IκB-α的水平显著降低,相反miR-145-5p的减少导致p-P65水平的显著下调,同时增加IκB-α的水平。5.对NF-κB通路进一步研究发现,miR-145-5p的过表达促进了可作为NF-κB通路活化标志物的P65由胞质入核。6.RA-FLS培养基中加入IL-17刺激细胞后,RA-FLS分泌MMP-9增多。结论MiR-145-5p过表达显著增加了 RA-CD4+T细胞中Th-17细胞的分化,增加了 IL-17的表达水平。同时RA-FLS中高表达的miR-145-5p可以通过激活NF-κB 通路促进 MMP-9 的表达,IL-17 也可以通过旁分泌的方式作用于 RA-FLS细胞,进一步促进MMP-9的表达从而加重关节骨与软骨的破坏,加速骨质侵蚀的过程,增加疾病的严重程度。
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