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第一章 ChIP-seq数据分析P300在乳腺癌细胞中的结合位点目的:为了揭示雌二醇(estrogen,E2)刺激前后乳腺癌细胞MCF7中P300结合位点的分布特征,筛选受雌激素受体信号激活的P300调控基因,确定P300及其调控基因在乳腺癌中的相关作用机制。方法:以E2刺激前后人类乳腺癌细胞MCF7中P300增强子结合蛋白的Ch IP-seq数据(GSE39623)为基础,首先分析了E2刺激前后P300结合位点在染色体上的分布情况,以及结合位点信号变化的差异。通过对P300结合位点周围基因的检测,对P300调控的靶基因进行了分析,进而结合GO数据库对这些靶基因进行了功能富集分析。此外,我们还确定了E2刺激前后与P300结合信号显著增强的特异性靶基因,并同时进行了GO功能富集分析。最后我们分别对E2刺激前后特异性的P300结合位点进行了Motif finding分析,并对E2刺激后新出现能够与P300发生共定位的转录因子进行了GO功能富集分析。结果:乳腺癌细胞MCF7中P300的结合位点主要集中在5’UTR区域、3’UTR区域、转录起始位点和转录终止位点两侧,而E2刺激后P300结合位点在TSS区域的分布密度出现少量上升。在E2刺激后确定的24899个差异P300结合位点中,39%位点的结合信号显著上升。E2刺激前P300调控的靶基因主要富集在与神经细胞分化相关的生物学过程,而E2刺激后富集在细胞连接、细胞粘附等过程的靶基因显著增多。此外,针对结合信号显著增强的P300调控靶基因功能富集分析结果发现这两组靶基因均与神经分化的功能相关,而E2刺激后细胞运动功能出现了大量基因的富集。最后,我们在E2刺激前后P300结合位点周围分别找到了225和176个Motif富集显著水平较高的转录因子。功能富集分析结果显示P300共定位转录因子主要富集在细胞增殖、分化、迁移等生物学过程。此外我们发现雌激素受体信号通路相关因子ESR1、BRCA1也能够与P300发生共定位。结论:P300在乳腺癌中发挥了广泛的转录调控作用,并与雌激素受体信号通路之间存在明显的相关性。第二章 PAX6和P300在人乳腺癌细胞和组织中的表达目的:为了揭示P300和PAX6在人乳腺癌细胞及组织中的表达情况。方法:本研究首先采用定量PCR的方法检测了PAX6及P300在人乳腺上皮细胞株HBL-100,人乳腺癌细胞株BT-474、MDA-MB-231、MCF-7中的表达水平。进而通过收集经手术切除临床雌激素受体阳性淋巴转移人乳腺癌组织样本30例,雌激素受体阳性无转移人乳腺癌组织样本30例以及相应的癌旁组织(非癌组织),同样采用定量PCR的方法检测了PAX6及P300在这些组织中的表达水平。结果:PAX6在人乳腺癌细胞系BT-474中高表达,而相对的乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7中的表达较低(P<0.01)。P300则在三种乳腺癌细胞系中高表达(P<0.01)。P300和PAX6在癌旁组织(非癌组织)中的表达低于相应的癌组织(P<0.05),且转移乳腺癌组织样本中P300和PAX6的表达明显高于非转移乳腺癌组织(P<0.05)。结论:PAX6和P300在乳腺癌中均高表达,且与乳腺癌的转移能力相关。第三章 P300基因敲除对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。目的:为了揭示P300对乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡、侵袭及迁移能力的影响。方法:本研究通过化学合成构建了3组si RNA片段(si P300-1,si P300-2及si P300-3)用于P300的沉默。转染乳腺癌细胞MCF-7后,我们首先通过定量PCR检测了该3组片段对P300的沉默效率,以及对肿瘤侵袭转移相关基因MMP9、VEGF和u PA表达的影响。接着通过Western blot验证了si P300-1对P300以及PAX6表达的影响。随后通过CCK-8、流式细胞仪检测了三组片段对乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响,并通过划痕实验以及Transwell侵袭实验检测了si P300-1对乳腺癌细胞MCF-7侵袭及迁移能力的影响。结果:si P300-1,si P300-2及si P300-3都可以明显抑制乳腺癌细胞MCF-7中P300的表达,但各组si RNA的抑制效果有所不同。si RNA转染3天后,si P300-1,si P300-2及si P300-3均表现出明显抑制MCF-7细胞活性的能力(P<0.05)。si RNA处理2天后,NC、si P300-1、si P300-2及si P300-3组细胞的凋亡率分别为18.22%、18.60%、21.94%、17.94%,组间无显著差异。P300沉默后,肿瘤侵袭转移基因MMP9、VEGF和u PA的表达明显受到抑制(P<0.05),并且明显减缓的愈合程度以及减少的细胞数目都进一步说明了乳腺癌细胞MCF-7的侵袭及迁移能力受到了抑制。此外乳腺癌细胞系MCF-7中PAX6的表达也受到了si P300-1的抑制。结论:si RNA可以有效的抑制乳腺癌细胞MCF-7中P300的表达,并进而抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖、侵袭及迁移能力,而乳腺癌细胞MCF-7的凋亡水平并未受到明显的影响。