一、研究背景Tsc1和Tsc2基因的名字来源于结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex, Tsc),这是一种严重的常染色体显性遗传疾病,当Tsc1和Tsc2中的一个或两个基因发生突变就会造成结节性硬化症(TSC)。结节性硬化症(TSC)的特点是多个器官和组织,包括真皮,平滑肌,肾和神经系统形成错构瘤。正由于Tsc1和Tsc2基因突变会带来严重的后果,这两个基因的功能受到了广泛的关注和研究。由Tsc1基因编码的hamartin蛋白质和由Tsc2基因编码的tuberin蛋白质在细胞内共同形成功能性异二聚体(TSC1/TSC2复合物),该复合物具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性,在控制细胞大小,细胞周期和细胞增殖的信号通路中发挥关键调节作用。TSC1和TSC2蛋白通过它们各自的卷曲螺旋结构域相互结合。TSC2蛋白质的C-末端含有GAP结构域,而TSC1蛋白则负责保护TSC2蛋白不受泛素介导的降解。研究表明,当在果蝇体内突变失活Tsc1或Tsc2中任一个基因,所引起的表型是相同的。因此,干扰或敲除Tsc1或Tsc2中的任何一个,都能有效抑制TSC1/TSC2复合物发挥生物学作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝氨酸-苏氨酸激酶,属于磷脂激酶相关激酶家族,它是TSC1/TSC2复合物的重要下游靶分子。mTOR主要以两种蛋白复合物的形式存在于细胞中并发挥激酶活性：mTOR复合物1 (mTOR complex 1, mTORC1)和mTOR复合物2 (mTORcomplex 2, mTORC2)。mTORC1由rnTOR以及4个调节蛋白：Raptor、PRAS40、 mLST8和DEPTOR共同构成。其所介导的信号通路负责接收作用于细胞的营养、能量、应激等信号,调节蛋白质翻译,进而调控细胞生长、增殖与自噬。小GTP酶Rheb (Ras-homology enriched in brain)是mTORC1的直接上游激活蛋白,而Rheb的活性由TSC1/TSC2复合物控制。TSC1/TSC2复合物与GTP结合状态的Rheb结合,并将GTP水解,转为GDP结合状态的Rheb丧失激酶活性,无法激活其下游的mTORC1。因此,TSC1/TSC2复合物实际上发挥着抑制mTORC1活性的作用。当营养、能量等信号刺激时,TSC1/TSC2复合物被磷酸化,导致它们与Rheb的结合被解除,Rheb的激酶活性恢复,进而激活mTORC1。当Tsc1或Tsc2基因缺失时,也就失去了TSC1/TSC2复合物对Rheb活性的抑制,从而导致mTORC1持续性激活。S6K和4EBP-1是位于mTORC1下游的两个重要效应蛋白,他们所调控的信号通路都与促进蛋白质合成有关,因而在细胞生长方面发挥重要调节作用。其中,S6K被mTORC1磷酸化激活后,可进一步磷酸化下游的核糖体蛋白S6,磷酸化的S6(p-S6)促进核糖体蛋白合成。因此,p-S6通常被视为mTORC1活化的指标。除了mTORC1, AKT也是调控细胞增殖与存活的重要蛋白。为了控制细胞的有序生长与增殖,促进细胞生长的信号不能被无限放大。因此,在mTORC1和AKT之间存在着负反馈调节。mTORC1激活的S6K一方面磷酸化S6促进蛋白质翻译,另一方面则通过磷酸化胰岛素受体底物-1(IRS-1)而破坏IRS-1与胰岛素受体或胰岛素样生长因子受体的结合,从而使胰岛素或胰岛素样生长因子信号不能正常传递到AKT分子,进而抑制AKT活性。这条负反馈调节通路在控制细胞生长和增殖方面起到重要的作用。组织和器官发育需要适当的细胞生长,增殖和凋亡,由此可推断mTORC1信号在组织器官发育中必定发挥着重要作用。然而,Tscl或Tsc2基因全身敲除的胚胎致死性阻碍了人们对mTORC1信号在组织器官发育中的作用的研究。在一些重要组织器官——比如乳腺的发育中,mTORC1信号起着怎样的作用尚未阐明。我们的研究采用Cre-LoxP系统建立乳腺管腔乳腺上皮细胞特异性敲除Tscl的小鼠模型,这种小鼠能够正常出生、成长、进入性成熟期,是研究mTORC1信号与乳腺发育的理想模型。有趣的是,我们的研究发现敲除小鼠乳腺上皮细胞Tsc1基因后,并没有如预期般造成乳腺上皮细胞过度增生,反而明显抑制了小鼠乳腺导管的发育。进一步的研究证明,适度的mTORC1活性对于青春期小鼠乳腺发育的极为重要。二、研究方法利用LoxP-flanked Tsc1 (Tsc1L/L)小鼠及MMTVCre+小鼠杂交构建乳腺上皮细胞特异性敲除Tsc1的模型小鼠(Tsc1L/LLMMTVCre+);通过Tsc1L/wt小鼠与MMTVCre+小鼠杂交获得Tscl未被敲除的Tsc1wt/wtMMTVCre+小鼠作为正常对照。小鼠于出生后4-6周处死,取第4对乳腺脂肪垫通过全乳腺包埋染色(Whole mount staining)观察乳腺发育情况,在高倍镜下计数乳腺二级导管数量及终末腺泡(TEB)数量。利用BrdU法检测乳腺上皮细胞增殖,利用TUNEL法检测乳腺上皮细胞凋亡。通过免疫组织化学法检测乳腺上皮TSC1、p-S6、p-PDK1、 p-AKT (ser308)、p-AKT (ser473)、IRS-1、ERa、cyclin D1、cyclin E、CDK4、 CDK2、p-Rb及p27kip1的表达。雷帕霉素逆转实验：4周大的小鼠给予腹腔注射雷帕霉素0.1 mg/kg,每2天1次,连续2周；取相同基因型相同周龄的小鼠腹腔注射生理盐水作为对照。2周后处死小鼠,进行上述实验。三、研究结果1.成功建立了乳腺上皮特异性敲除Tsc1基因的小鼠模型；2.Tsc1基因敲除抑制小鼠乳腺导管发育,使小鼠乳腺上皮细胞增殖降低而凋亡增加；3.Tsc1基因敲除乳腺上皮细胞的p-S6表达上调,mTORC1抑制剂雷帕霉素可逆转该小鼠乳腺p-S6的上调并一定程度上恢复乳腺导管发育,说明mTORC1活性增高导致该小鼠乳腺发育障碍；同时,相同剂量的雷帕霉素作用于正常基因型小鼠也引起乳腺导管发育障碍,提示适当的mTORC1活性对乳腺正常发育至关重要；4.Tsc1基因敲除乳腺上皮细胞的AKT蛋白活性下调,该下调可被雷帕霉素逆转,提示mTORC1持续激活对AKT的负反馈抑制可能是导致乳腺上皮细胞增殖抑制、凋亡增加的机制之一；5.Tscl基因敲除抑制乳腺上皮细胞的ERa及IRS-1的核内表达下调,该下调可被雷帕霉素逆转,提示ERa的核内信号通路被抑制可能是Tscl基因敲除导致乳腺发育障碍的机制之一；6.Tsc1基因敲除乳腺上皮的细胞周期相关蛋白Cyclin D1,Cyclin E, CDK2及CDK4的表达下调,该下调可被雷帕霉素逆转,提示Tscl基因敲除可能通过下调细胞周期蛋白表达抑制乳腺上皮细胞增殖,从而导致乳腺导管发育障碍。四、研究结论。综上所述,本课题研究敲除Tsc1基因在小鼠乳腺导管发育中的作用,发现适当的mTORC1活性对小鼠青春期乳腺导管的发育至关重要。mTORC1持续激活或者活性不足都会导致青春期小鼠乳腺导管发育障碍。Tscl基因敲除导致乳腺发育受阻的分子机制可能包括：1,mTORC1的持续性激活负反馈抑制AKT活性,从而使乳腺上皮细胞增殖抑制,凋亡增加；2,通过抑制ERα的核信号通路抑制乳腺上皮细胞增殖;3,通过下调乳腺上皮细胞细胞核中Cyclin D1, Cylin E, CDK2和CDK4的表达,阻止细胞周期进程。我们推测,ERa, cyclin D1, cyclin E, CDK2和CDK4的表达下调均与AKT活性降低有关。mTORC1的持续性激活所导致的AKT活性下降在Tsc1敲除诱导的乳腺发育障碍中应该起到了关键作用。