研究背景子宫内膜癌(Endometrial carcinoma,EC)是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,占女性全身恶性肿瘤的7%,占女性生殖系统恶性肿瘤的20-30%。平均发病年龄为60岁,其中75%发生于50岁以上的妇女。近年来发病率在世界范围内呈上升和年轻化的趋势。目前认为子宫内膜癌有两种发病类型,Ⅰ型是雌激素依赖型,均为子宫内膜样腺癌。Ⅱ型是非雌激素依赖型,发病与雌激素无明确关系,病理形态属少见类型,如子宫内膜浆液性癌、透明细胞癌、腺鳞癌等。早期子宫内膜样腺癌预后相对较好,但晚期或复发的患者和Ⅱ型子宫内膜癌患者预后不良。子宫内膜癌的一线治疗方案是手术及辅助放化疗。对晚期或者复发的患者以及渴望保留生育功能的患者,可以使用激素疗法,包括孕激素、促黄体激素释放激素激动剂、抗雌激素类以及芳香酶抑制剂。其中,孕激素为首选,对孕激素受体阳性者有效率可达80%。但是,多项研究已经证实,许多子宫内膜癌患者对孕激素并不敏感。因此,探究新的治疗靶点和治疗药物对子宫内膜癌的治疗具有重要的临床意义。固醇调节原件结合蛋白(Sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs)是脂代谢的关键调节者,它们通过转录性地调节维持脂肪酸和胆固醇代谢平衡的基因来发挥作用。在哺乳动物的细胞中,SREBPs有三种亚型(SREBP-1a,SREBP-1c和SREBP-2),分别由两种基因(SREBF1和SREBF2)进行编码。研究表明SREBP-1是脂肪酸代谢的主要调节者,而SREBP-2是胆固醇代谢的主要调节者。许多研究已经证实SREBPs在许多恶性肿瘤中具有癌基因的作用,能通过调节脂代谢促进癌症的进展。我们课题组先前的研究发现,与邻近的正常子宫内膜相比,子宫内膜癌组织中SREBP-1的表达水平是明显增高的,并且表达水平与癌症的进展成正相关;子宫内膜癌细胞中SREBP-1的敲除能抑制子宫内膜癌细胞的增殖、降低其克隆形成能力和促进凋亡。这些研究表明SREBP-1在子宫内膜癌中具有癌基因的作用,通过药物干预阻断SREBP调控的脂代谢通路有望成为子宫内膜癌新的治疗方法。脂肪抑制素(fatostatin)是SREBP通路的一种化学抑制剂,能抑制SREBPs的成熟和核转运。Kamisuki等已经证实脂肪抑制素增加了肥胖ob/ob小鼠的脂肪酸动员和氧化,降低了脂肪生成,同时表现出较低的细胞毒性。另外,Li X等发现,不管是体内还是体外,脂肪抑制素对前列腺癌都具有抗肿瘤作用,且该作用是通过阻断SREBP调控的代谢途径和雄激素受体来实现的。Siqingaowa等已证实,脂肪抑制素能降低胰腺癌细胞的生长和增殖。因此,我们推测脂肪抑制素可能通过SREBP在子宫内膜癌中发挥抗肿瘤作用。但目前为止,尚无脂肪抑制素对子宫内膜癌作用及相关机制方面的研究。本研究旨在探讨脂肪抑制素对子宫内膜癌的抗肿瘤作用及其潜在的可能分子机制,为子宫内膜癌的治疗提供新的理论依据。第一部分脂肪抑制素对子宫内膜癌的抗肿瘤作用目的:研究脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A)增殖、克隆形成能力、侵袭及迁移能力以及细胞周期、细胞凋亡的影响,探讨脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞的抗肿瘤作用。方法:本研究应用MTT技术检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A)增殖的影响,使用GraphPad Prism 5软件计算出半数抑制浓度(50%Inhibitory Concentration,IC50)值。用MTT技术检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞生长曲线的影响。应用平板克隆形成实验检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞克隆形成能力的影响。应用Transwell小室体外细胞侵袭和迁移实验检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力的影响。应用流式细胞术检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:1.MTT实验结果显示:脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞的增殖有明显的抑制作用,且具有时间和剂量依赖性。根据所得的细胞增殖率,使用GraphPad Prism 5软件计算出脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A两种细胞的72小时IC50值分别为17.96μmol/L和4.53μmol/L。MTT实验研究脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞生长曲线的影响的结果显示:与空白对照组相比,脂肪抑制素组细胞的OD值明显降低,P均<0.01,有统计学差异,且具有时间和剂量依赖性。2.平板克隆形成实验结果显示:与空白对照组相比,两种细胞脂肪抑制素组的克隆形成率明显降低,细胞克隆形成能力明显下降,P均<0.01,有统计学差异,且具有剂量依赖性。3.Transwell小室体外细胞侵袭实验结果显示:与空白对照组相比,两种细胞脂肪抑制素组的侵袭细胞数目明显降低,细胞侵袭能力明显下降,P均<0.01,有统计学差异。4.Transwell小室体外细胞迁移实验结果显示:与空白对照组相比,两种细胞脂肪抑制素组的迁移细胞数目明显降低,细胞迁移能力明显下降,P均<0.01,有统计学差异。5.流式细胞术检测脂肪抑制素对Ishikawa细胞周期的影响实验的主要结果显示:与空白对照组相比,在脂肪抑制素较高浓度(20、40μM)时,脂肪抑制素组处于G2/M期的细胞百分比明显增加,P均<0.01,有统计学差异;处于G0-G1期和S期的细胞百分比明显减少,P均<0.05,有统计学差异。6.流式细胞术检测脂肪抑制素对HEC-1A细胞周期的影响实验的主要结果显示:与空白对照组相比,在脂肪抑制素较高浓度(10μM)时,脂肪抑制素组处于G2/M期和S期的细胞百分比明显增加,P均<0.01,有统计学差异;处于G0-G1期的细胞百分比明显减少,P=0.0002,有统计学差异。7.流式细胞术检测脂肪抑制素对Ishikawa细胞凋亡的影响实验的主要结果显示:与空白对照组相比,在脂肪抑制素较高浓度(20、40μM)时,脂肪抑制素组早期凋亡+晚期凋亡细胞的百分比、早期凋亡细胞的百分比均明显增加,P均<0.05,有统计学差异;晚期凋亡细胞的百分比仅在脂肪抑制素40μM组明显增加,P=0.0447,有统计学差异。8.流式细胞术检测脂肪抑制素对HEC-1A细胞凋亡的影响实验的主要结果显示:与空白对照组相比,在脂肪抑制素较高浓度(l0μM)时,脂肪抑制素组早期凋亡+晚期凋亡细胞的百分比、早期凋亡细胞的百分比均明显增加,P均<0.01,有统计学差异;而晚期凋亡细胞的百分比没有明显变化,P=0.2658,无统计学差异。结论:1.脂肪抑制素能抑制子宫内膜癌细胞的增殖,且脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A两种细胞的72小时IC50值分别为17.96和4.53μmol/L。2.脂肪抑制素能抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力。3.脂肪抑制素能抑制子宫内膜癌细胞的侵袭和迁移能力。4.较高浓度的脂肪抑制素能促进子宫内膜癌细胞的凋亡,并使细胞周期停滞在G2/M期。5.脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞有明显的抗肿瘤作用,有望成为子宫内膜癌新的治疗药物。第二部分脂肪抑制素对子宫内膜癌抗肿瘤作用的分子机制研究目的:研究脂肪抑制素作用于子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A)后两种细胞脂代谢相关蛋白和脂代谢相关分子mRNA水平的变化以及游离脂肪酸和总胆固醇含量的变化,同时研究凋亡调节蛋白caspase-9、caspase-3、PARP的变化,探讨脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞抗肿瘤作用的分子机制。方法:应用Western-blot技术检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A)脂代谢相关蛋白以及凋亡调节蛋白caspase-9、caspase-3、PARP表达的影响。应用qRT-PCR技术检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞(Ishikawa和HEC-1A)脂代谢相关分子和脂代谢分子伴侣mRNA水平的影响。应用游离脂肪酸定量检测试剂盒检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞游离脂肪酸含量的影响。应用总胆固醇定量检测试剂盒检测脂肪抑制素对子宫内膜癌细胞总胆固醇含量的影响。结果:1.Western-blot技术检测脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A凋亡调节蛋白表达的影响的结果显示:脂肪抑制素降低了 Ishikawa和HEC-1A凋亡调节蛋白F-caspase-9、F-caspase-3、F-PARP的表达水平,增加了相应的活化蛋白C-caspase-9、C-caspase-3、C-PARP 的水平,P 均<0.05,均有统计学差异。2.Western-blot技术检测脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A脂代谢相关蛋白表达的影响的结果显示:脂肪抑制素治疗后,两种细胞的P-SREBP-1和P-SREBP-2蛋白表达变化不明显,P均>0.05,无统计学差异;N-SREBP-1和N-SREBP-2蛋白表达明显降低,P均<0.05,有统计学差异;FASN和HMGCR蛋白表达明显降低,P均<0.05,有统计学差异。3.qRT-PCR技术检测脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A脂代谢相关分子的mmRNA表达的影响的结果显示:脂肪抑制素治疗后,两种细胞的三个脂肪酸代谢相关分子、五个胆固醇代谢相关分子、两个脂代谢分子伴侣的mRNA表达均明显降低,P均<0.05,有统计学差异。4.游离脂肪酸定量检测试剂盒检测脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A游离脂肪酸(FFA)含量的影响的结果显示:与空白对照组相比,两种细胞脂肪抑制素组FFA的含量明显降低,P均<0.05,有统计学差异。5.总胆固醇定量检测试剂盒检测脂肪抑制素对Ishikawa和HEC-1A总胆固醇(TC)含量的影响的结果显示:与空白对照组相比,两种细胞脂肪抑制素组TC的含量明显降低,P均<0.01,有统计学差异。结论:1.脂肪抑制素降低了子宫内膜癌细胞中脂代谢相关分子的蛋白水平及mRNA水平,阻断了 SREBP调控的脂代谢通路。2.脂肪抑制素降低了子宫内膜癌细胞中游离脂肪酸及总胆固醇的含量,进一步证实了脂肪抑制素对SREBP脂代谢通路的阻断作用。3.脂肪抑制素降低了子宫内膜癌细胞中凋亡调节蛋白F-caspase-9、F-caspase-3、F-PARP 的水平,增加了相应的活化蛋白 C-caspase-9、C-caspase-3、C-PARP的水平,诱导了 caspase介导的细胞凋亡。4.在子宫内膜癌中,脂肪抑制素阻断了 SREBP调控的脂代谢通路,诱导了caspase介导的细胞凋亡,这可能是脂肪抑制素对子宫内膜癌抗肿瘤作用的潜在分子机制。