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在雌性哺乳动物卵巢中,卵泡闭锁是一种周期性进行的常见生理现象。在卵泡闭锁过程中,卵巢中的绝大多数卵泡发生了退化并且消失。目前对卵泡闭锁分子机制的探索尚不深入。近来的研究证明,卵泡闭锁的主要标志是颗粒细胞凋亡。Foxo转录因子是Forkhead蛋白家族的一个亚群。Foxo蛋白参与了细胞凋亡、细胞周期阻滞、DNA损伤修复、氧化应激等众多生命活动过程。已经证明,在雌性哺乳动物中Foxo可以通过多条通路对卵泡的生长、成熟和闭锁进行调控。近来的研究表明,在几种特定的细胞中,氧化应激能激活Foxo,促进细胞凋亡。但是氧化应激、Foxo、颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁之间的联系仍不清楚。作为影响卵泡发育的重要存活因子,FSH在有腔卵泡中,能通过阻止颗粒细胞的凋亡来抑制卵泡闭锁。已有文献证实FSH对Foxo1的表达和活性均有抑制作用。所以FSH-Foxol通路很可能是控制颗粒细胞存活及卵泡闭锁的一条重要途径。为验证该假设,有必要对FSH挽救颗粒细胞凋亡与Foxo1之间的相关性,以及FSH调控Foxo1的具体机制进行探索。本论文选取小鼠卵巢为研究对象,主要试验结果如下：1 Foxo1是氧化应激诱导的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡的关键调节因子(1)体内、外氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡伴随Foxo1表达的显著升高给小鼠注射3埘P后能特异性引起卵泡中颗粒细胞的氧化应激,进而诱导细胞凋亡和凋亡相关基因的表达。与Foxo家族的其他成员相比,氧化应激对卵泡颗粒细胞中Foxo1的诱导效果最明显。在体外培养的颗粒细胞中用H202处理模拟生理状态下的氧化应激导致了颗粒细胞凋亡、凋亡相关基因表达、Foxo1表达及活性水平的显著上升。(2)超表达Foxo1基因促进了颗粒细胞凋亡在体外培养的小鼠颗粒细胞中超表达Foxo1显著增加了细胞的凋亡水平。Foxo1质粒转染组的颗粒细胞普遍表现出Foxo1的细胞核定位。超表达野生型Foxo1的颗粒细胞中凋亡相关基因Bim、TRAIL、FasL及caspase-3的转录水平显著升高。(3)干涉Foxol基因表达有效降低了H202处理引起的颗粒细胞凋亡RNAi显著降低了H202处理引起的Foxol表达上调,并阻断了颗粒细胞中Foxol的细胞核定位。氧化应激条件下敲减Foxol有效抑制了颗粒细胞凋亡和凋亡相关基因Bim、TRAIL、FasL及caspase-3的表达。(4)胰岛素通过阻断Foxo1活性抑制了H2O2处理引起的颗粒细胞凋亡在添加了胰岛素的体外培养颗粒细胞中,氧化应激诱导的Foxo1入核受到明显抑制。胰岛素处理阻止了氧化应激引起的颗粒细胞凋亡。胰岛素存在时,氧化应激无法上调凋亡相关基因Bim、TRAIL、FasL及caspase-3的转录。2 Foxo1参与了FSH挽救小鼠颗粒细胞凋亡的调控(1)FSH抑制了小鼠优势卵泡中Foxol依赖性的颗粒细胞凋亡在闭锁的优势卵泡中,凋亡主要发生在颗粒细胞。随着闭锁的进行,颗粒细胞的凋亡程度也逐渐加深。相反,用FSH处理抑制卵泡闭锁后,显著降低了优势卵泡中颗粒细胞的凋亡率。FSH可以通过抑制线粒体途径来挽救颗粒细胞凋亡。在颗粒细胞中表达的Foxo家族成员中,Foxo1对FSH的调控表现的最为敏感。FSH可以通过抑制Foxo1的表达挽救颗粒细胞凋亡。Bim是FSH挽救凋亡中连接Foxo1通路和线粒体通路的媒介。(2)FSH通过PKA-PI3K-AKT-Foxol轴促进颗粒细胞的存活对众多的FSH信号通路进行检测,发现FSH可以通过激活PKA、PI3K、AKT通路抑制优势卵泡颗粒细胞中Foxo1的表达及活性,同时抑制颗粒细胞凋亡。这三条通路中,PKA处于最上游,P13K次之,处于下游的AKT直接引起Foxo1的磷酸化失活。相反,Foxo1蛋白中对应的AKT磷酸化位点的组成型激活突变阻断了FSH对颗粒细胞凋亡的挽救。(3)颗粒细胞中Foxo1的调控是一个自我强化的过程研究发现,在来源于小鼠优势卵泡的颗粒细胞中,Foxo1转录因子可以结合在Foxo1基因启动子的FRE (Foxo-recognized element)位点,促进自身及下游Bim基因的表达,诱导颗粒细胞凋亡。FSH通过PKA-PI3K-AKT轴引起Foxo1的磷酸化出核,导致Foxo1及下游凋亡相关靶基因的启动子中Foxo1蛋白的结合量减少,从而使这些基因的表达减弱,因此颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁可以被FSH所挽救。(4)FSH可能通过ERalpha来调控Foxo1的表达通过生物信息学方法和查阅文献,选取了8个在Foxo1启动子区有TFBS (transcriptional factor binding sites)的转录因子,检测到其中6个在优势卵泡颗粒细胞中表达。发现在FSH信号通路挽救颗粒凋亡过程中,ERalpha的表达模式和Foxo1的表达模式具有显著相关性,表明ERalpha可能是FSH挽救颗粒细胞凋亡时用来调节Foxo1功能的另一分子开关。综上所述,本文研究了Foxo1转录因子在颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁中的作用及其调控机制,建立了氧化应激、Foxol、颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁之间的关系,发现了Foxol在氧化应激诱导的小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中发挥了核心作用,证明了FSH-Foxo1途径与颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的相关性,揭示了FSH挽救颗粒细胞凋亡过程中与Foxol调控相关的信号通路,阐明了FSH信号通路影响下Foxol表达和Foxol活性的关系,并对该过程中Foxol的上游调控因子做了初步筛选。Foxol对小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的调控研究,进一步丰富了卵泡闭锁的分子机制,为治疗排卵障碍相关疾病、提高家畜繁殖率、提高辅助生殖助孕技术的受胎率等领域提供了一个潜在的作用靶点。