【摘 要】
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结核病（Tuberculosis,TB）是一种在全球范围内流行的慢性致死人畜共患传染性疾病。在发展中国家野生及家养动物中感染现象普遍存在。但结核分枝杆菌在长期的高浓度药物环境中常出现耐药现象,药物治疗反而增加结核分枝杆菌对社会的危害性。因此研究耐药性结核分枝杆菌产生的机制尤为重要。耐药性产生的机制中主动外排机制是主要的原因之一,且外排泵在参与菌体生理代谢的同时,对保护菌体阻止药物进入也至关重要。本
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结核病（Tuberculosis,TB）是一种在全球范围内流行的慢性致死人畜共患传染性疾病。在发展中国家野生及家养动物中感染现象普遍存在。但结核分枝杆菌在长期的高浓度药物环境中常出现耐药现象,药物治疗反而增加结核分枝杆菌对社会的危害性。因此研究耐药性结核分枝杆菌产生的机制尤为重要。耐药性产生的机制中主动外排机制是主要的原因之一,且外排泵在参与菌体生理代谢的同时,对保护菌体阻止药物进入也至关重要。本课题主要以ATP结合盒家族转运蛋白Rv0820在耻垢分枝杆菌中的同源蛋白Ms＿5779为研究对象,用生物信息学预测发现Rv0820与耻垢分枝杆菌的Ms＿5779高度同源,并预测其可能是与药物外排相关的转运蛋白,为了进一步验证Rv0820的功能,实验运用CRISPR技术对耻垢分枝杆菌中Rv0820同源基因Ms＿5779进行干扰,成功将CRISPR技术运用于耻垢分枝杆菌的同时,探究Ms＿5779基因功能,为Rv0820的功能研究奠定基础。1、CRISPR技术干扰耻垢分枝杆菌Ms＿5779系统的建立CRISPR技术由p RH2502（表达d Cas9蛋白）和p RH2521（连接Sg RNA）组成,将设计的Sg RNA同源重组到p RH2521质粒后电转于Ms-p RH2502（d Cas9）中,并用荧光定量PCR验证基因表达抑制率达到80%,基因干扰成功。2、耻垢分枝杆菌Ms＿5779体外生存研究通过对干扰Ms＿5779表达的细菌活性检测分析,结果发现Ms＿5779不参与菌体生长的调控,且对利福平,异烟肼,诺氟沙星更加敏感。对生物膜及膜结构通透性检测发现Ms＿5779通过改变渗透屏障参与药物外排;同时实验通过压力测试发现Ms＿5779影响耻垢分枝杆菌对外界压力的耐受,表明Ms＿5779蛋白是重要的细胞壁结构蛋白。3、干扰Ms＿5779表达菌株对巨噬细胞的作用研究使用Raw264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞,初步探究干扰Ms＿5779基因对菌株侵染细胞的影响,通过CCK-8细胞增殖实验,发现抑制Ms＿5779的表达会影响菌体在细胞中的存活,一氧化氮含量检测进一步证明了CCK-8的结果,实验检测了细胞的胆固醇含量并进行了油红（O）染色,最后检测细胞凋亡,菌株感染力明显降低。推测对Ms＿5779进行干扰会减弱菌株对细胞的感染力,影响菌株对细胞防御功能的抵御能力。综上,实验成功运用CRISPR技术干扰Ms＿5779基因,且CRISPR技术是用于探究结核分枝杆菌功能未知的必需基因的有效工具。Ms＿5779基因与结核分枝杆菌Rv0820高度同源,且作为外排泵蛋白是重要的细胞壁结构,会影响药物耐受,降低耻垢分枝杆菌在压力下的存活能力,侵染巨噬细胞的能力减弱,这为Rv0820在结核分枝杆菌中的作用提供新思路。
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