为了给消费者提供优质绿色的动物产品,同时提高我国畜产品的国际竞争力,研制抗生素或化学类生长促进剂的替代物是中国饲料添加剂工业面临的一个重大课题。目前认为抗生素替代品有很多,如植物提取物、微生态制剂、酶制剂以及抗菌肽等,抗菌肽的生物学特性:(1)生物学活性范围广;(2)作用迅速、效果稳定;(3)不易产生耐药性;(4)对包膜病毒、真菌、癌细胞等均有作用;(5)没有药物残留。天蚕素是从蚕蛹中分离的,属于首例发现的动物抗菌肽,在1980年,瑞典科学家G.Boman等人发现的,定名为cecropins。本论文主要筛选得到高效分泌表达天蚕素的枯草芽孢杆菌宿主菌及其中试发酵工艺优化、天蚕素的发酵液分离纯化和初步应用试验。论文的主要结果如下:(1)天蚕素在不同枯草芽孢杆菌的表达含量的比较。将表达载体分别转化入三株宿主菌株后,实现重组天蚕素异源表达,然后用SDS-PAGE和高效液相法比较三株菌株cecropin AD表达量。经SDS-PAGE和高效液相法分析,三株菌株都能产生分子量为3.8 k Da的小肽,但经过比较发现重组cecropin AD在宿主菌WB800表达效率最高,含量达到826.72μg/ml。(2)将从实验室筛选得到的宿主菌WB800进行中试发酵工艺优化。本文以枯草芽孢杆菌WB800为供试菌株,依托实验室前期工作基础以Design-Expert响应面分析软件为基础,通过其Box-Behnken Design(BBD)来设计实验方法,通过p H值、通风量、转速三个因变量的分析比较,以最终天蚕素产量为唯一响应值,通过设计实验方案,找出最佳发酵工艺条件,为CAD的工业化生产提供数据支持。通过实验我们可以得出,当发酵液的p H值达到7.60,转速达到230 r/min,其通风量达到5.00L/h的时候,天蚕素表达量会达到一个理论最高值,即979.98μg/ml,通过三次验证实际含量能达到961.52μg/ml,可以进行产业化生产。(3)以从第一章获得的能高表达量天蚕素菌种WB800为宿主菌,以第二章优化后的发酵工艺进行发酵,获得待纯化的发酵液;根据天蚕素的理化性质首先设计了纯化路线;其次是在纯化的每个步骤进行纯化填料的摸索、条件优化;最后将整个纯化工艺进行贯通,纯化出天蚕素的纯品进行检测、鉴定。研究表明:发酵液经过离子交换层析后收集到的样品用反相色谱的方法检测纯度为69.5%,疏水层析后纯度为87.4%,最终检测天蚕素纯品的纯度为100%;纯品对于G-与G+均有一定的抑制与杀灭作用。(4)将天蚕素饲料添加剂产品加到猪日粮中,观察其对断奶仔猪生长性能和免疫功能的影响。选取体重为8.46±0.12 kg的杜×大×长三元杂交猪360头,采用单因子完全随机设计,分为4个处理,每个处理6个重复(栏),每个重复(栏)15头猪,对照组:基础日粮(无药物,玉米-豆粕型);药物组:基础日粮+25 mg/kg维吉尼亚霉素+100 mg/kg土霉素+60 mg/kg硫酸抗敌素(药物以有效含量计);天蚕素组:基础日粮+400 mg/kg天蚕素;配伍组:基础日粮+250 mg/kg天蚕素+50 mg/kg土霉素+20 mg/kg硫酸抗敌素(药物以有效含量计),研究天蚕素对断奶仔猪生产性能和免疫功能的影响。结果表明,天蚕素组及配伍组较抗生素组及对照组在仔猪饲料转化率方面均差异显著(P<0.05),在日增重及日采食量方面均有改善的趋势;在腹泻率及猪瘟抗体水平方面,试验各组均显著优于对照组(P<0.05),其中对于天蚕素组平均抗体阻断率显著优于其余三个组(P<0.05);天蚕素组在血清生化指标BUN、GLU、TP及Ig G、Ig A方面有显著改善作用(P<0.05)。(5)在北京、河北、河南等规模化猪场推广应用中,在仔猪饲料转化率方面、成活率和腹泻率均取得良好应用效果,每头猪给养殖户增加经济效益达13-16元。因此,天蚕素添加到保育猪饲料中可以部分替代吉他霉素、维吉尼亚霉素等抗G+饲用抗生素使用量和降低硫酸粘杆菌素使用量。综上所述,通过对三株枯草芽孢杆菌筛选获得了能高效表达天蚕素的菌株WB800,同时通过优化发酵工艺获得了能产业化生产的工艺条件,根据天蚕素特点摸索得到最适分离纯化工艺,并获取到100%纯品。对断奶仔猪的应用表明,能有效减少或完全取代抗生素的使用。