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中枢神经系统疾病如神经变性病、脑缺血、脊髓损伤、中枢神经系统肿瘤等长期以来都缺乏良好的治疗方法。由于神经元的损伤不能修复,因此使得依赖于特定神经元和神经递质的生理功能受到破坏。近年来,人们在研究造血发生和神经发育的基础上开始对神经发生的前体细胞进行研究。神经前体细胞是一类多能干细胞,能够长期自我复制,并具有分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多潜能特性。神经前体细胞的发现给中枢神经系统疾病的细胞替代治疗带来了希望,然而如何能显著增加神经前体细胞的增殖能力及其向神经元的分化潜能,从而为疾病治疗提供更加丰富的细胞来源,仍是目前干细胞研究和应用过程中亟待解决的问题。
近年来,大量研究表明低氧可以在体内外促进神经前体细胞的增殖及其向多巴胺能神经元的分化,但相应的机制目前还不十分清楚。低氧可以使细胞膜上氧气敏感性钾通道活性降低,使得细胞膜去极化进而激活电压依赖性钙通道,钙离子通过电压依赖性钙通道进入胞内,使胞内钙离子浓度升高,进而启动一系列的下游效应,如细胞收缩,囊泡释放,突触传递以及基因表达等。已有文献报导,在神经细胞上,L型电压依赖性钙通道调节了一些与其活性相关的进程,如高钾刺激通过增强L型钙通道的活性而促进了体外培养的海马神经前体细胞的增殖。基于此,本研究的目的旨在探讨L型钙通道是否参与了低氧促进神经前体细胞增殖的过程,明确低氧促进神经前体细胞增殖的机制,以期为进一步研究低氧促进神经前体细胞分化的机制奠定基础。
方法和结果:
1.胎鼠中脑来源的神经前体细胞的分离、培养和鉴定:
1.1 将急性分离的孕14.5天胚胎大鼠中脑单细胞悬液置于添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的神经干细胞优势培养基Neurobasal A中培养,并采用免疫荧光染色的方法对神经前体细胞纯度进行鉴定,第 2 代培养的细胞其表达神经前体细胞标志蛋白-巢蛋白(nestin)和SOX2的纯度均达到90％以上;
1.2 培养基中撤去生长因子之后更换成分化培养基,神经前体细胞可多潜能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
2.低氧对胎鼠中脑来源的神经前体细胞增殖的作用:
2.1 细胞计数结果表明:3％O2环境下培养的神经前体细胞数目显著多于20％O2环境下培养的神经前体细胞数目；
2.25-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入实验及对BrdU免疫荧光染色结果表明3％O2环境下培养的神经前体细胞增殖能力显著高于20％O2组；
2.3 对3％O2和20％O2环境下培养的神经前体细胞进行TUNEL染色,结果表明:与常氧组相比,低氧并不能诱导显著的细胞凋亡。
3.L型钙通道在低氧促神经前体细胞增殖中的作用:
3.1 细胞计数和CCK-8检测结果表明:L型钙通道阻断剂-尼卡地平的加入可以拮抗低氧对神经前体细胞的促增殖作用,而其他电压依赖性钙通道阻断剂,包括P/Q型钙通道阻断剂-ω-agatoxin IVA,N 型钙通道阻断剂-ω-conotoxin GVIA,T型钙通道阻断剂-NiCl2的加入没有作用:
3.2 通过免疫荧光染色和western杂交对3％O2和20％O2环境下培养的神经前体细胞L型钙通道(Cav1.2/Cav1.3)的表达情况进行鉴定,结果表明:与20％O2组相比,3％O2环境下培养的神经前体细胞Cav1.3的表达上调,而Cav1.2的表达没有显著变化；
3.3 Real-time PCR检测结果表明:与20％O2组相比,3％O2下培养的神经前体细胞Cav1.3的mRNA水平上调,而Cav1.2的mRNA水平没有显著变化:
3.4 通过钙成像技术对神经前体细胞内钙离子浓度进行测定:3％O2条件下培养的细胞内钙离子浓度显著高于20％ O2；而将灌流液中的钙离子去掉之后,3％O2组细胞内钙离子浓度发生了显著降低,20％O2组没有显著变化,这表明低氧条件下细胞内增多的钙离子来源于细胞外钙离子的进入；向灌流液中加入L型钙通道的阻断剂-尼卡地平之后,3％O2组细胞内钙离子浓度同样发生了显著下降,而20％O2组没有显著变化,这提示低氧条件下细胞内增多的钙离子是通过L型钙通道进入的。
结论:
本研究首次对L型钙通道在低氧促进神经前体细胞增殖中的作用进行研究。采用神经前体细胞纯度达90％以上的培养体系进行细胞计数、CCK-8检测、BrdU掺入及TUNEL染色鉴定,证明3％O2条件可以显著促进胎鼠中脑来源的神经前体细胞的增殖；通过免疫荧光染色、westerm杂交和real-time PCR检测证明与20％O2组相比,3％O2条件下培养的神经前体细胞Cav1.3的表达上调,而Cav1.2的表达没有显著变化；采用钙成像技术证明与20％O2组相比,3％O2条件下培养的神经前体细胞内的钙离子浓度显著增多,这些增多的钙离子是来源于细胞外的钙离子通过L型钙通道进入到细胞内。这表明,低氧可能是通过促进L型钙通道的表达和开放来发挥促进神经前体细胞增殖的作用,为进一步揭示低氧作用原理、研究低氧促进神经前体细胞分化的机制奠定了基础。