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灵敏、准确的双链DNA(dsDNA)定量方法在生物学研究及应用领域中发挥着重要的作用，尤其对微量DNA定量时，如定量肿瘤患者血浆游离循环DNA(freecirculatingDNA)，法医取证DNA及用于亚克隆的DNA片断等，定量方法的灵敏度及准确度均需达到较高的标准。紫外分光光度法是目前使用较多的DNA定量方法，此方法操作简便，成本低，但不能区分双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、RNA及单核苷酸，易受到盐离子浓度、pH及DNA提取试剂残留的影响。荧光定量法是一种灵敏的DNA定量方法，将荧光染料与dsDNA结合，利用荧光分光光度计采集结合后增强的荧光信号，通过DNA标准样品所制得的标准曲线计算出样品DNA的初始浓度。本研究基于SYBRGreenI荧光发光原理，利用实时荧光定量PCR仪特有的四色荧光检测通道及荧光信号采集系统，加入ROX作为校正染料，通过与紫外分光光度法进行比较，分析定量过程的影响因素，通过荧光斑点染色法进行验证，以达到建立一种高精度，高通量的双链DNA定量方法的目的。本论文主要研究内容如下：
一、SYBRGreenIdsDNA定量方法的建立将梯度稀释的已知浓度λDNA与等体积的SYBRGreenI充分混合，设定参数，建立运行程序，利用荧光定量PCR仪采集荧光信号，以ROX作为校正染料进行定量分析。SYBRGreenI荧光定量法在0.015-2ng/μl浓度范围内呈线性关系(R2=0.9996)，检测限可达0.015ng/μl。此方法检测范围不受生物样本DNA含量或生物样本量的限制，可以满足微量DNA定量要求，为分子生物学研究及临床检验等多个领域提供了一种可靠的dsDNA定量方法。
二、SYBRGreenI荧光定量法与紫外分光光度法比较将λDNA.进行2倍系列稀释，浓度范围为0.03～256ng/μl；将酶解法制备的小鼠脑组织基因组DNA粗提物进行2倍系列稀释，以λDNA为标准曲线；稀释好的DNA样品用SYBRGreenⅠ荧光定量法进行定量，紫外分光光度计平行读数，比较两种定量方法的灵敏度与准确度。SYBRGreenⅠ荧光定量法比紫外分光光度法灵敏100倍以上，并可准确定量低纯度的DNA样品；SYBRgreenⅠ荧光定量法可在组织均浆液中进行基因组DNA定量，并实现在同一份生物样本中进行DNA定量及总RNA提取，为miRNA表达水平单细胞标准化方法研究奠定基础。
三、SYBRGreenⅠ荧光定量的影响因素将λDNA梯度稀释样品进行一系列变性后复性及酶切处理，分析DNA双链结构的稳定性及DNA片断长度对荧光SYBRGreenⅠ荧光定量的影响，并利用SYBRGreenⅠ荧光斑点染色进行验证。酶切后的λDNA与完整的λDNA荧光定量结果无显著差异；对λDNA梯度稀释样品分别在加入染料前后进行一系列温度处理后，两种处理方法的定量结果在30-65℃范围内无显著变化，随着温度的上升，标准曲线斜率均呈下降趋势，当进行95℃变性复性处理时，两种处理方法标准曲线的斜率分别下降98.4％与46.8％，SYBRGreenI斑点染色验证结果与荧光定量结果基本相符。λDNA经HindⅢ酶切后，可产生的最小片断为125bp时，荧光定量结果并没有受到DNA片断长度的限制，但DNA双链结构稳定与否直接影响了荧光定量结果的准确性，所以应避免由于机械剪切力、提取试剂、溶解温度等造成的DNA双链完整性及稳定性的破坏。