背景：糖尿病脑病（Diabetes encephalopathy, DE）是糖尿病（Diabetes mellitus, DM）严重并发症之一，损害患者的认知和记忆。传统治疗采用噻唑烷二酮（Thiazolidinedione, TZD）类过氧化物酶体增殖物激活受体（Perioxisomeproliferator-activated receptor-γ, PPAR-γ）激动剂控制血糖，辅以改善脑细胞功能的药物，目前尚无特效治疗药物。TZD类药控制血糖作用良好，但因脂溶性低，难以通过血脑屏障（Blood brain barrier, BBB），防治神经损伤作用有限。由此，研发降糖效果好、能顺利通过血脑屏障的药物将填补这一空白，具有非常重要的临床意义。目的：烷基取代的苯并咪唑基团亲水性低脂溶性高，生物相容性好。为此，我们将烷基取代的苯并咪唑基团与TZD基团连接，合成含苯并咪唑基的TZD类PPAR-γ激动剂系列化合物H2、H4和H6；采用体外高糖损伤神经元模型，结合细胞免疫荧光、蛋白免疫印迹和流式细胞术，筛选出神经保护作用药效最好的化合物H2；初步药代动力学结果提示，化合物H2透过BBB；建立2型糖尿病（Type2Diabetes Mellitus，T2DM）大鼠模型，进一步考察化合物H2对糖尿病脑病的治疗作用。结果显示H2显著提高大鼠生存率、降低血糖，同时，H2明显改善大鼠的学习、记忆行为；生化指标提示，化合物H2神经保护作用可能是通过降低血中炎性因子白细胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）、肿瘤坏死因子-（Tumor necrosis factor-, TNF-）和脑内丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平，以及提高血中抗炎因子IL-10和脑内抗氧化物质超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）水平发挥作用。本研究为发掘新型糖尿病脑病治疗药物初步奠定了基础。方法：一、新型含苯并咪唑基的TZD类化合物H2、H4和H6的合成1．酸性条件下，取代的邻氨基苯与1-氯直链羧酸缩合得到取代苯并咪唑缩合产物；2.4-羟基苯甲醛与2,4-噻唑烷二酮反应生成5-(4-羟基苯亚甲基)噻唑烷-2,4-二酮（H7），再经硼氢化钠还原得到中间体5-(4-羟基苯甲基)噻唑烷-2,4-二酮（H8）；3.合成苯并咪唑中间体2-氯甲基-1H-苯并咪唑（H1）、2-(氯甲基)-5-甲基-1H-苯并咪唑（H3）、2-(氯甲基)-1-甲基-1H-苯并咪唑（H5）；4.苯并咪唑中间体H1、H3、H5与噻唑烷二酮中间体H8缩合得到目标化合物H2、H4、H6；二、新型含苯并咪唑基的TZD类化合物H2、H4和H6的体外神经保护作用研究1.蛋白免疫印迹实验培养的神经元高糖（30mM）刺激24h后，给予不同浓度（0.1、1.0、10μM）化合物H2、H4、H6继续作用24h。Western blot方法检测与糖尿病病理进展、神经毒性相关的蛋白醛糖还原酶（Aldose reductase，AR）、缺氧诱导因子-1（Hypoxiainducible factor-1，HIF-1）、Bax，Pro-caspase-3等在神经元表达的变化，同时设立等渗透压的甘露醇（Mannitol）及母核药物罗格列酮（Rosiglitazone, RGZ）作为对照。2.细胞免疫荧光实验培养的神经元高糖（30mM）刺激24h后，给予不同浓度（0.1、1.0、10μM）化合物H2继续作用24h，同时设立等渗透压的甘露醇及母核药物RGZ作为对照。细胞免疫荧光染色神经元骨架蛋白MAP2（Microtubule-associated protein2），观察合成化合物对神经元形态学的影响。3.流式细胞实验培养的神经元高糖（30mM）刺激24h后，给予不同浓度（0.1、1.0、10μM）化合物H2作用24h，同时设立等渗透压的甘露醇及母核药物RGZ作为对照。流式细胞术检测合成化合物H2对神经元凋亡的影响。三、化合物H2药代动力学研究1．用反相高效液相色谱法，流动相为0.01mol/L NH4Ac：CH3OH（35:65，V/V），流速1mL/min，检测波长247nm，RGZ为内标。大鼠腹腔注射25mg/kg化合物H2，于给药后0、0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4h眼眶采血，高效液相色谱（High performanceliquid chromatography，HPLC）检测血中H2浓度，确定H2在SD大鼠血浆中的药代动力学参数。2.根据预实验结果，大鼠腹腔注射25mg/kg化合物H2后0.25h，取脑组织，制作脑组织匀浆，HPLC法检测脑中H2的浓度。四、化合物H2对糖尿病脑病的治疗作用1．建立T2DM模型和急性焦虑模型T2DM模型：高糖高脂饲料喂养SD大鼠4周，诱导发生胰岛素抵抗，再腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）30mg/kg维持高糖高脂饮食8周，即T2DM模型。急性焦虑模型：SD大鼠束缚2h/d，连续2次，建立急性焦虑模型。2．Morris水迷宫实验将造模成功的T2DM大鼠分为T2DM组，低、中、高剂量H2治疗组（1mg/kg，3mg/kg，10mg/kg）和RGZ治疗组（3mg/kg），动物给予药物治疗4周，正常组给予相同体积生理盐水。Morris水迷宫实验以逃避潜伏期和穿越平台次数考察H2对T2DM大鼠学习记忆的保护作用。3．高架十字迷宫实验SD大鼠分为正常组、H2（3mg/kg）组和焦虑组。将大鼠面朝开臂放在中央区域，迷宫上方采用视频记录并分析5min内大鼠进入开臂或闭臂（四爪全部入臂）的次数与时间。以进入开臂的次数和滞留时间作为衡量焦虑的指标，总入臂次数则用于自主活动的检测。4．生化指标检测水迷宫实验结束后，SD大鼠心脏取血并取脑组织制作脑组织匀浆，用南京建成试剂盒测定血浆IL-1β、TNF-和IL-10及脑皮质匀浆SOD、CAT、GSH-Px和MDA的水平。结果：一、H2、H4和H6的合成合成得到3个目标化合物H2、H4、H6，并通过1H NMR和MS鉴定其结构。另外，合成过程中还得到中间体H5及副产物H55的晶体，并用X-射线表征其结构。二、新型含苯并咪唑基的TZD类化合物H2、H4和H6的体外神经保护作用研究1.化合物H2、H4和H6对高糖培养神经元细胞的影响Western blot结果显示高糖可升高AR、HIF-1、Bax，降低Pro-caspase-3在神经元的表达；与正常对照组比较，高糖组神经元AR、HIF-1、Bax和Pro-caspase-3表达有显著差异；为排除渗透压对培养体系的影响，同时设置等渗透压即30mM甘露醇作为对照，结果显示，甘露醇对神经元中AR、HIF-1、Bax和Pro-caspase-3的表达没有影响，与正常对照组相当，排除渗透压对神经元细胞生长状态的影响。化合物H2、H4、H6可以逆转高糖培养神经元AR、HIF-1、Bax和Pro-caspase-3的表达水平，且H2效果最佳。2.化合物H2对神经元细胞形态的影响高糖处理神经元24h，可造成明显的细胞骨架形态改变，表现为骨架蛋白MAP2染色神经元突起不连续，成断线状改变。给予化合物H2处理24h则神经元突起形态基本恢复正常。3.化合物H2对神经元细胞凋亡的影响高糖损伤24h未引起显著的神经细胞凋亡，各治疗组亦未见细胞凋亡；可能高糖条件不能诱导细胞凋亡，流式细胞术检测高糖引起的神经元凋亡不是敏感指标，无法评价H2的神经保护作用。三、化合物H2药代动力学研究本研究建立一种简单、安全、经济的方法检测血和脑组织中H2的HPLC-UV方法，分析结果准确、灵敏。大鼠腹腔注射给药25mg/kg时，AUC(0-)为（14.58±1.45）mg/L*h，Tmax为（0.17±0）h，CLz/F为（1.73±0.17）L/h/kg，t1/2为（0.73±0.075）h，Cmax为（26.39±1.02）μg/mL。H2能透过血脑屏障，给药后0.0833h脑中浓度为1.57ng/g。四、化合物H2对糖尿病脑功能异常的治疗作用1．一般指标观察T2DM大鼠造模成功后体重持续下降，且出现多饮、多尿、多食等症状，空腹血糖>7.8mmol/L。正常组大鼠体重持续增长，毛皮及精神状态良好。给予药物治疗4周后，与T2DM组比较，低、中、高剂量H2组和RGZ组大鼠空腹血糖显著下降（p <0.01）；T2DM组和RGZ组大鼠生存率分别为67.5%和75%，低、中、高剂量H2组大鼠全部存活，明显提高了T2DM大鼠生存率。2．Morris水迷宫结果药物治疗4周后，与正常组大鼠比较，T2DM组大鼠逃避潜伏期显著升高（p <0.01），提示T2DM大鼠出现认知功能障碍。药物治疗组中，与T2DM组比较，低、中、高剂量H2组及RGZ组逃避潜伏期显著减小（p <0.05、p <0.01、p <0.01和p <0.05）。高剂量H2组逃避潜伏期显著小于RGZ组（p＜0.05）。在d6撤去平台后，与正常组比较，T2DM模型组大鼠跨越平台次数显著减少（p<0.01）。药物治疗组中，中、高剂量H2组比RGZ组跨越平台次数显著增加（p <0.05，p <0.01）。3．H2对T2DM大鼠白内障的预防T2DM大鼠治疗过程中，观察到各组T2DM大鼠不同程度出现肉眼可见的晶状体浑浊。根据本校第二附属医院眼科晶状体分级系统，对大鼠晶状体的浑浊程度进行分级。与正常对照组比较，T2DM组晶状体浑浊显著（p <0.01）；与T2DM组比较，低、中、高剂量H2治疗组晶状体浑浊程度显著减轻（p <0.01）；与RGZ组比较，中、高剂量H2治疗组晶状体浑浊程度显著减轻（p <0.01）。4．高架十字实验焦虑模型组大鼠在开臂内滞留时间与空白对照组比较具有显著性差异（p <0.05），说明急性焦虑模型成功。但H2治疗组与焦虑模型组在进入开臂的次数和滞留时间上未见显著性差异。5．生化指标检测大鼠血浆炎症因子IL-1β、TNF-和抗炎因子IL-10水平：与正常组比较，T2DM组IL-1β和TNF-显著升高（p <0.05，p <0.01），IL-10显著降低（p <0.01）；与T2DM组大鼠比较，低、中、高剂量H2组IL-1β水平有显著降低（p <0.05，p <0.01，p <0.01）；与T2DM组大鼠比较，中、高剂量H2组TNF-水平有显著降低（p <0.05，p <0.01），其中高剂量H2组与RGZ比较有显著降低（p <0.05）；与T2DM组大鼠比较，低、中、高剂量H2组IL-10水平均有显著升高（p <0.05，p <0.05，p <0.01），其中高剂量H2组与RGZ组比较显著升高（p <0.05）。大鼠脑匀浆SOD、CAT、GSH-Px和MDA水平：与正常组比较，T2DM组SOD、CAT和GSH-Px水平显著降低（p <0.01），MDA水平显著升高（p <0.01）；与T2DM组大鼠比较，低、中、高剂量H2组SOD水平显著升高（p <0.05，p <0.01，p <0.05），且与RGZ组比较有显著升高（p <0.05，p <0.01，p <0.05）；与T2DM组大鼠比较，中、高剂量H2组CAT水平显著升高（p <0.05），且与RGZ组比较有显著升高（p <0.05）；与T2DM组大鼠比较，低、中、高剂量H2组GSH-Px水平显著升高（p <0.05），且高剂量H2组与RGZ组比较有显著升高（p <0.05）；与T2DM组大鼠比较，低、中、高剂量H2组MDA水平均有显著降低（p <0.01），且中、高剂量H2组与RGZ组比较有显著降低（p <0.05，p <0.01）。结论：1．体外神经保护作用Western blot结果表明，高糖损伤24h后，糖代谢相关蛋白AR、HIF-1表达水平增高；凋亡相关蛋白Bax的表达水平增高，Pro-Caspase-3蛋白的表达水平降低，表明高糖造成神经元糖代谢异常，引起神经元的早期损伤。合成化合物H2、H4和H6降低AR、HIF-1和Bax蛋白的表达，从而抑制了神经元的损伤。这些结果表明，化合物H2、H4和H6能抑制高糖引起的糖代谢异常，对高糖损伤的神经元有一定的保护作用，其中H2药效强于H4和H6。高糖损伤24h可造成神经元骨架形态的改变，表现为骨架蛋白MAP2染色神经元突起不连续，成断线状。合成药H2治疗后神经元突起形态基本恢复正常，发挥神经保护作用。高糖处理神经元24h，细胞凋亡不显著，这可能由于糖尿病引起的神经损伤是一长期过程，体外高糖作用时间较短，因而流式细胞术检测高糖引起的神经元凋亡不是敏感指标。2．化合物H2药代动力学研究SD大鼠腹腔给药后15min脑中H2含量为1.57μg/g，此时间点血浆中浓度为26.4μg/mL，说明H2能够通过血脑屏障。有文献报道，脑脊液中母核药物RGZ浓度仅为血中的0.0045%[1]。我们的检测体系未能检测到脑组织中的RGZ，可能是由于脑内RGZ浓度低于检测基线。具体原因还有待进一步考证。相同方法下，脑组织中能检测到H2而不能检测到RGZ，提示H2通过血脑屏障的能力要强于RGZ。3．化合物H2对糖尿病脑功能障碍的治疗作用大量研究结果显示，T2DM患者出现学习记忆、认知功能障碍等中枢神经系统（Central nervous system, CNS）损害的临床症状。Morris水迷宫实验是研究啮齿类动物学习、记忆能力的公认模型，能客观、准确地评价动物的认知功能。通过考察动物的逃避潜伏期、穿越平台次数等主要指标来衡量动物的学习、记忆功能。本实验两项指标的结果提示，H2能改善T2DM大鼠的认知功能障碍，且效果优于阳性对照药RGZ。通过检测T2DM大鼠血浆和脑匀浆相关生化指标发现，H2抑制炎症相关因子IL-1β和TNF-的表达，提高抗炎性细胞因子IL-10的表达，从而减轻糖尿病时自身免疫性和慢性炎症反应，发挥治疗作用。另外，H2治疗后脑中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性提高以及脂肪氧化终产物丙二醛（MDA）水平降低，且中、高剂量药效要优于RGZ。该结果提示H2能改善脑内酶抗氧化系统的活性，提高机体的抗氧化能力，清除各种活性氧对机体的损伤，减少脂肪氧化产生毒性物质（MDA），发挥神经保护作用。另有研究表明，焦虑情绪的缓解对糖尿病患者的治疗有积极意义[2]。我们考察H2对焦虑是否具有潜在的治疗意义，结果提示H2对急性焦虑没有明显作用，对于慢性焦虑的作用还有待研究。4．对白内障的预防作用糖尿病患者晚期往往眼部病变。实验中，我们观察到T2DM大鼠先后出现白内障， H2治疗组白内障的发生率及严重程度均显著下降。此结果提示，化合物H2在T2DM大鼠模型白内障形成及预防方面的潜在治疗价值。综上所述，离体实验中化合物H2与罗格列酮对高糖介导的神经元损伤具有相似的保护作用；T2DM大鼠的治疗中，合成化合物H2的药效要优于RGZ。