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一、背景肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，但肝癌的发病机制至今仍不完全清楚。70-90%的肝癌患者发病大多有长期慢性乙型病毒性肝炎病史，表现为经典的“乙肝-肝硬化-肝癌”的三步曲模式。肝硬化状态被认为是肝癌的癌前病变，且临床诊治的肝癌患者大多已处于肝硬化代偿或失代偿期，而在肝硬化基础上如何发生发展成为肝癌这一具体机制尚不完全清楚，因此十分有必要对这一疾病状态下的发病机制进行深入探讨，从而为临床肝癌的诊治提供新的思路和手段。部分研究已证实交感神经对肿瘤发生发展的重要调控作用。Tatsuta M的研究表明在实验性大鼠结肠癌模型中，通过6-OHDA(六羟基多巴胺)对大鼠进行化学性交感神经去除后，可以显著地降低结肠癌的发生率以及减少肿瘤的数量，明确了交感神经系统对结肠癌发生发展中的重要作用；此外，在大鼠胃癌诱导过程中，通过刺激肾上腺素α1受体介导肾上腺素能受体明显增强了胃癌的发生率，相反地，采用6-OHDA进行去交感神经后，胃癌肿瘤的数量明显减少，证实了交感神经在胃癌中的重要作用。但交感神经是否也参与了肝癌的发生发展过程这一关键问题尚不明确。多项研究已证实在肝硬化患者及大鼠肝硬化模型中，肝内交感神经纤维的分布伴随着假小叶的形成而发生改变，肝脏内的交感神经表现为过度兴奋状态,这种过度兴奋状态促使交感神经末梢释放大量的去甲肾上腺素。部分研究也证实去甲肾上腺素可以作用于Kupffer细胞上的肾上腺素能受体，导致Kupffer细胞释放大量炎症因子。而其它相关研究也表明肝脏炎症微环境长期作用可导致肝细胞损伤、死亡和代偿性增生并通过激活NF-κB和STAT3通路最终导致肝癌的形成。但是，在此过程中交感神经是否通过调控Kupffer细胞参与了肝癌的发生发展过程尚不清楚。基于以上研究，本课题设想在肝硬化下，交感神经过度兴奋释放大量去甲肾上腺素作用于Kupffer细胞的肾上腺素能受体，促使Kupffer细胞释放大量炎症因子形成炎症微环境并长期作用于肝细胞，最终导致了肝癌的发生发展。因此，本课题通过化学性去交感神经末梢(6-OHDA，六羟基多巴胺)、阻断Kupffer细胞肾上腺素能受体(Prazosin，哌唑嗪)和清除Kupffer细胞(GaCl3，氯化钆)三种阻断方式，探讨不同方式阻断交感神经调控和清除Kupffer细胞对诱导大鼠肝癌形成的影响及其机制，从而初步阐明交感神经调控Kupffer细胞活化促进肝癌形成及其机制。二、目的通过建立DEN(二乙基亚硝胺)诱导的大鼠肝癌模型，探讨不同方式阻断交感神经调控及清除Kupffer细胞对大鼠肝癌形成的影响及其机制，初步阐明交感神经调控Kupffer细胞活化促进肝癌形成的机制。三、方法1通过DEN诱导建立大鼠肝癌模型，观察诱癌过程中肝脏大体及组织病理变化，免疫组化检测Kupffer细胞在诱癌过程中的动态变化。2统计分析Kupffer细胞数量在诱癌过程中的变化，并采用RT-PCR方法检测Kupffer细胞相关炎症因子和肝癌干细胞标志在诱癌过程中的动态表达，筛选出变化趋势明显的因子，探讨筛选出的炎症因子与肝癌干细胞标志的相关性。3观察化学性去交感神经末梢(6-OHDA，六羟基多巴胺)、阻断Kupffer细胞去甲肾上腺素能受体(Prazosin，哌唑嗪)和清除Kupffer细胞(GaCl3，氯化钆)对DEN诱导大鼠肝癌的成瘤率及肿瘤数目和大小的影响。同时将第二部分筛选出的因子在各实验组中进行检测验证，分析该结果与肝癌形成的相关性。四、结果1成功建立DEN诱导大鼠肝癌模型，动态观察肝脏组织病理形态，大致经历：慢性炎症肝损伤期(1-12周)、肝增生纤维化期(12-16周)、肝硬化加重期(16-20周)和肝癌形成期(20-24周)，确定肝硬化形成期在诱癌第16周左右，肝癌形成在第24周左右。2Kupffer细胞数量在诱癌过程中呈现逐渐增多的趋势。并且通过RT-PCR方法检测Kupffer细胞相关炎症因子及肝癌干细胞标志在诱癌过程中的动态表达，结果筛选出IL-6、TGF-β和CD90指标在诱癌过程中显著升高，且IL-6、TGF-β与CD90的动态变化趋势呈明显正相关。3采用6-OHDA化学性去交感神经末梢、Prazosin阻断Kupffer细胞肾上腺素能受体和GaCl3清除Kupffer细胞后，显著降低大鼠肝癌成瘤率及肿瘤数目和大小。且Prazosin实验组、GaCl3实验组和6-OHDA实验组中IL-6、TGF-β和CD90的表达比DEN诱导模型组明显降低。五、结论1通过成功建立DEN诱导大鼠肝癌模型，动态观察其肝脏组织病理形态，模拟了“慢性炎症—肝硬化—肝癌”形成过程。2Kupffer细胞数量及其分泌的IL-6、TGF-β随诱癌过程进展逐渐升高，同时肝癌干细胞标志CD90也呈进行性升高。在诱癌过程中IL-6、TGF-β与CD90的动态变化存在明显正相关性，表明Kupffer细胞释放的IL-6、TGF-β与肝癌的发生发展过程明显相关。3交感神经通过调控Kupffer细胞释放炎症因子促使肝癌的发生。