论文部分内容阅读
目的：研究RNA干扰及厄洛替尼两种途径阻断表皮生长因子受体(EGFR)信号对肺腺癌A549细胞株形态学的影响,EGFRmRNA表达、凋亡率及EGFR及Bcl-2. Bax蛋白表达的变化,从而为肺癌的分子靶向治疗提供新思维。方法：人肺腺癌A549细胞株以含10%胎牛血清的PRMI1640完全培养基培养于37℃、5%C02饱和湿度的恒温箱内。实验分正常对照组、厄洛替尼组、RNA干扰组。EGFR基因中的序列以及siRNA设计原则设计合成设计相应的siRNA,并转染A549细胞48h后提取总RNA,采用RT-PCR技术检测转染后A549细胞株中EGFRmRNA的变化。取适量DMSO液溶解厄洛替尼母液,均于实验前以PRMI1640培养基稀释至501amol/L,药物干预48h。倒置相差显微镜下观察各实验组细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测EGFR、Bcl-2、Bax蛋臼的变化。买验数据以X2+s表示,用SPSS12.0软件进行统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：1、倒置相差显微镜下细胞形态学变化A.空白对照组：细胞生长良好,紧贴瓶壁排列,可见细胞核分裂相。B.厄洛替尼组：细胞间隙增宽,正常细胞形态消失,细胞贴壁疏松,仍见多量贴壁生长的细胞。C.RNA干扰组：细胞生长抑制更为显著,细胞形态不能辨认,细胞皱缩脱落呈透亮空泡,无贴壁生长细胞。2.、RT-PCR检测EGFRmRNA/GAPDH相对光密度比值影响。空白对照组、阴性RNA对照组、实验组、脂质体2000对照组EGFRmRNA/GAPDH相对光密度值分别为0.76、0.72、0.31、0.70,阴性RNA对照组及脂质体2000对照组与与空白对照组差异无统计(P>0.05)学意义,而实验组光密度值较空白对照组差异显著(P<0.05),证实RNA干扰可抑制EGFR基因表达。3、流式细胞术检测细胞凋亡的变化.流式细胞术分析显示：对照组、厄洛替尼组、RNA干扰组肺腺癌A549细胞的凋亡率分别为23.5%、57.4%、83.2%,阻断EGFR信号途径可促进A549细胞凋亡,其差异较对照组有统计学意义((P<0.05)。4、Western blot检测EGFR、Bcl-2、Bax相对蛋白量表达的影响Western blot分析显示与对照组相比,厄洛替尼组及RNA干扰组EGFR表达降低,Bcl-2水平表达降低,Bax蛋白表达增高。相对蛋白量分析示：厄洛替尼组及RNA干扰组Bcl-2、Bax表达较对照组差异显著,有统计学意义((P<0.05)。厄洛替尼组及RNA干扰组Bcl-2/Bax比值分别为0.40、0.21,差异较对照组(6.67)有统计学意义。结论阻断EGFR信号途径可促进肺腺癌A549细胞凋亡,其机制可能与降低Bcl-2/Bax比值水平相关。