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铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKitnuraetMigo)为我国特有的石斛属药用植物,早在《神农本草经》中就有记载,具有滋阴生津、润肺明目、抗癌防老等功效。近年来,由于铁皮石斛保健品和药品的大规模开发,不但使其野生资源遭受毁灭性的破坏,而且还导致了铁皮石斛混淆品的泛滥,因此亟须建立有效的铁皮石斛种质鉴别的可靠手段。
在植物基因组中,由于微卫星寡核苷酸的重复次数在同一物种的不同基因型间具有差异且相对稳定,因而SSR标记呈现高度多态性,可用于植物种质的鉴别。关于铁皮石斛SSR标记的开发和应用,本文主要进行了如下三个方面的研究:(一)运用磁珠富集法开发铁皮石斛的微卫星铁皮石斛微卫星的开发步骤如下:(1)用Sau3AI酶切铁皮石斛基因组DNA,加接头进行连接;(2)根据接头的序列设计引物进行PCR,用生物素标记的(AGA)8和(AC)15两种探针于不同杂交温度分别与之杂交;(3)利用链霉亲和素包裹的磁珠富集含有微卫星DNA的片段,再进行PCR.扩增;(4)微卫星序列的克隆测序。本研究共成功开发出197条微卫星序列,并设计了60对微卫星引物。利用这60对引物初步扩增随机选取的48个铁皮石斛贵州居群样本,经过扩增产物稳定、条带清晰、多态性高等方面的筛选,共选取了15对SSR引物用于本实验的研究。(二)探讨铁皮石斛的SSR.标记在石斛属其它植物上的通用性运用所选的15对铁皮石斛的SSR引物,对20种石斛属植物进行跨种扩增检测,除XML004,XML007在石斛种间无相应大小范围的SSR扩增产物外,其它SSR引物在20个石斛属种材料上能全部或部分扩增出清晰地SSR条带,并在种间存在一定的多态性,其中有9对(60％)引物在所有供试材料上都能扩增出条带,通用率达到了86.7％。(三)运用SSR标记进行铁皮石斛种质纯度鉴定和真实性判别随机抽取福建某居群种质(FJ02)的500株组培苗,对其4个SSR位点(XML003、XML005、XML006、XML008)的带型进行统计。检测出3个特殊单株在4个SSR位点均存在带型差异,因此可以确定在500株中有497株是同一种质品种,其它3株为机械操作导致的混杂株,品种纯度为99.4％。该鉴定结果在组培苗成长后已得到形态学验证,为铁皮石斛的真实性和品种纯度鉴定提供遗传学依据。