一、背景肝外胆管癌是起源于肝外胆管上皮细胞的恶性肿瘤，由于其早期就可发生侵袭转移，预后极差。近年来其发病率有增高趋势。手术切除是目前治疗的主要方法，然而许多病人在行手术之前就已经发生了淋巴结侵犯或远处转移，使手术无法达到根治；此外还有许多病人，即便是采取了手术切除，但术后2年内就出现肿瘤复发，这些均严重影响了病人的预后。因此，寻找新的抗肿瘤转移治疗的靶点和预后分析的靶点十分必要。层粘连蛋白332(laminin332)，是一种大分子量的糖蛋白，由α3、β3、γ2三条链构成的异源性三聚体。目前已知的层粘连蛋白家族中有15个亚型，它们的基因序列和结构相似，不同的细胞表达不同的层粘连蛋白亚型，laminin332是唯一在上皮细胞广泛分布的亚型，它是上皮组织基底膜重要组成部分，通过与其受体结合在介导细胞与基底膜粘附及细胞的迁移、生长、分化中发挥重要的生物学作用。从层粘连蛋白的结构来看，lamininγ2链是laminin332特有组成成分，且该链能够以单体形式分泌，许多研究把lamininγ2作为laminin332检测的代表。文献报道在许多肿瘤中存在lamininγ2的过表达，并且与侵袭转移显著相关。在一些研究中把lamininγ2在肿瘤细胞中的表达作为判断病人预后的标志。既往研究发现，肝内胆管癌中lamininγ2的表达与肿瘤的恶性转化以及病人预后相关，但由于肝外胆管癌发病率占胆管癌总数的80%-90%，并且两者的形态学及发病机理不同，目前lamininγ2在肝外胆管癌中的表达及作用未见报道，本次实验将围绕这一方面做初步研究。二、研究假说Lamininγ2在肝外胆管癌细胞中表达升高，能够促进肿瘤细胞侵袭转移，并且可能作为判断病人预后的标志，为临床抗肿瘤转移靶向性治疗和预后分析提供实验依据。三、材料方法1、收集2005-2010年西南医院肝胆外科行胆管癌切除术病人的病例资料和组织标本。其中肝外胆管癌72例、癌旁16例、炎性肝外胆管8例、胆管腺瘤5例；收集72例肝外胆管癌病人的淋巴结转移组织28例和肝转移组织7例。来源于肝外胆管癌患者的细胞株QBC939为西南医院肝胆外科自建。2、通过免疫组化染色，对比肝外胆管癌、癌旁、炎性胆管、胆管腺瘤组织中lamininγ2表达差异；分析lamininγ2在肝外胆管癌中的表达情况与肿瘤临床病理学特征的相关性；对比淋巴结转移灶和肝转移灶与原发灶组织中lamininγ2表达的差异。3、随访72例肝外胆管癌病人的死亡时间和/或肿瘤复发时间，根据手术日期计算出病人术后总生存时间和无瘤存活时间。分别使用Kaplan-Meier和Cox模型，分析肝外胆管癌中lamininγ2表达与病人预后的关系。4、应用RNA干扰技术下调肝外胆管癌细胞(QBC939)lamininγ2表达，采用Transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验观察下调lamininγ2对肝外胆管癌细胞侵袭和迁移能力的影响。四、结果：1、Lamininγ2在肝外胆管癌中存在两种表达类型：肿瘤细胞胞浆表达和/或肿瘤细胞外基质表达；72例肝外胆管癌组织中，28例肿瘤细胞外基质染色阳性，24例肿瘤细胞胞浆染色阳性，16例既有肿瘤细胞胞浆染色阳性又有肿瘤细胞外基质染色阳性；16例癌旁、5例肝外胆管腺瘤及8例炎性胆管上皮细胞lamininγ2染色均为阴性。将lamininγ2表达分为肿瘤细胞外基质表达组和肿瘤细胞胞浆表达组，分别与肿瘤的临床病理学参数行相关性分析提示：肿瘤细胞外基质lamininγ2表达与淋巴结转移显著相关(p=0.01)；肿瘤细胞胞浆lamininγ2表达与淋巴结转移和远处器官转移显著相关(p=0.02；p=0.01)；28例淋巴结转移灶组织中，17例lamininγ2肿瘤细胞胞浆染色阳性，高于其在原发灶胞浆表达水平(P=0.01)；7例肝转移灶组织中，4例lamininγ2肿瘤细胞胞浆染色阳性，高于其在原发灶胞浆表达水平。上述结果提示：肝外胆管癌中lamininγ2异常表达与肿瘤的侵袭转移相关。2、Kaplan-Meier模型生存分析提示：肝外胆管癌细胞外基质或胞浆lamininγ2表达阳性病人的术后总生存时间显著低于lamininγ2表达阴性的病人(log-rank p=0.007；p=0.008)；肝外胆管癌细胞外基质或胞浆lamininγ2表达阳性病人的术后肿瘤复发时间显著早于lamininγ2表达阴性的病人(log-rank P=0.004；P=0.006)。然后我们将lamininγ2表达情况进行分组：细胞外基质和胞浆均阳性组；细胞外基质阳性、胞浆阴性组；胞外基质阴性、胞浆阳性组；细胞外基质和胞浆均阴性组。分析提示无论肝外胆管癌lamininγ2是哪种类型表达阳性，其病人术后总生存时间均显著低于lamininγ2表达阴性的病人(log-rank P=0.001)；无论肝外胆管癌lamininγ2是哪种类型表达阳性，其病人术后肿瘤复发时间均显著早于lamininγ2表达阴性的病人(log-rank p<0.001)。Cox模型分析提示lamininγ2表达是判断肝外胆管癌术后病人存活时间和肿瘤复发相对独立危险因素(HR=2.465，95%CI=1.391-4.368，p=0.002；HR=2.679，95%CI=1.547-4.638，p<0.001)。上述结果提示：肝外胆管癌lamininγ2异常表达可能是判断病人预后的分子标志。3、体外实验中采用免疫荧光法检测发现，lamininγ2表达在QBC939细胞胞浆。在QBC939细胞中，干扰lamininγ2的表达显著抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。结果提示：lamininγ2促进了肝外胆管癌细胞侵袭和迁移。五、结论肝外胆管癌中存在lamininγ2的异常表达，并且该分子的表达促进了肿瘤细胞的侵袭转移，可能是判断病人预后的潜在分子标志。