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目的: 建立一种基于生物素-亲和素放大系统的时间分辨荧光免疫分析（BA-TRFIA）检测CK-MB新方法，在建立方法之前首先构建PET28a-CK-MB重组质粒，诱导表达及纯化CK-MB重组蛋白，并以其为参考标准品来建立BA-TRFIA检测CK-MB新方法。 方法: 1. 人肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的原核可溶性表达、纯化及抗原性的鉴定 先将CK-M基因和CK-B基因分别与pMD19-T克隆载体连接，然后将连接成功的CKB-pMD19-T与PET28a表达载体连接;然后将连接成功CKM-pMD19-T与CKB-PET28a连接;最后将构建成功的PET28a-CK-MB重组质粒转化入感受态细胞中，诱导表达并纯化重组蛋白CK-MB。通过时间分辨荧光免疫分析方法对纯化后的CK-MB重组蛋白进行抗原性鉴定及稳定性研究。 2. BA-TRFIA方法的建立以本课题组表达制备的重组蛋白CK-MB作为参考标准品，将抗CK-MB抗体H30330M包被到固相板上，对检测抗体H31795M进行生物素标记及用Eu3+对链霉亲和素(SA)进行标记。采用双抗体夹心法，优化包被抗体浓度、生物素标记抗体用量、Eu3+-SA用量，确定最佳反应条件，初步建立BA-TRFIA检测CK-MB方法。 3. 方法学评价对BA-TRFIA方法进行方法学评价，评价指标包括特异性、标准曲线、最低检测限、批内/批间精密度。 4. 临床应用使用本方法检测150例健康体检者血清中CK-MB水平以计算出参考值范围和阴性预测值及阳性确认值。同时使用本方法和化学发光免疫分析方法（CLIA）检测100例CK-MB阴性标本和150例心肌梗死患者CK-MB水平进行方法学比对。 结果: 1. 人肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）的制备PCR、酶切及序列比对三种鉴定结果显示，成功构建了PET28a-CK-MB重组质粒，并诱导表达出重组蛋白CK-MB，蛋白表达量占菌体总蛋白的55％以上，经SDS-PAGE鉴定后，重组蛋白CK-MB在破菌上清及包涵体中均有表达，分子量约为92KD。对收集破菌上清进行镍柱亲和层析纯化，纯度可达90％。纯化后的重组蛋白CK-MB能够与羊抗人CK-MB单抗特异性结合且在加入10％ BSA、2mmol/L EDTA的蛋白保护剂，-20℃保存条件下活性基本不变，稳定性很好。 2. BA-TRFIA方法的建立本课题成功将包被抗体H30330M共价偶联到固相板上，并成功对检测抗体H31795M进行生物素标记及对SA进行Eu3+标记。最佳反应条件为:包被抗体H30330M最佳浓度3μg/ml、生物素化检测抗体B-H31795M及Eu3+-SA最佳稀释度均为1∶100;选择孵育温度为37℃，反应时间均为30min。 3. 方法学评价BA-TRFIA检测CK-MB的工作范围为0-400μg/L，相关系数为0.9423，最低检测限为0.1μg/L。批内、批间精密度分别为1.3％～11.2％、8.0％～10.3％，与CK-MM、CK-BB、肌钙蛋白I及肌钙蛋白T均无交叉反应。 4. 临床应用对150例临床健康体检者血清标本进行检测，结果显示健康体检者血清CK-MB蛋白含量为0～0.81μg/L，阴性预测值为96％、阳性确认值为0.426μg/L。方法学比对结果显示两种方法具有很强的相关性(r=0.92)。BA-TRFIA检测150例CK-MB阳性标本结果与患者相应的心电图、cTnⅠ、BNP的检测结果相符。 结论: 本实验成功构建了PET28a-CK-MB原核表达系统，并且使重组蛋白CK-MB得到高效表达。纯化后的CK-MB能够与羊抗人CK-MB单抗特异性结合。本研究建立的BA-TRFIA方法具有灵敏度高、特异性强及较宽的检测范围等优势，能够满足临床诊断的相关要求，可初步应用于临床人血清CK-MB的检测。