杨树小GTPase(guanosine triphosphatase)中PtArlAla基因功能的研究

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小G蛋白(small GTPase)广泛的存在于动物、植物和酵母中。通过在结构以及功能上的划分,可以把小G蛋白家族分为Rab、Rho、Ras、Sar/Arf及Ran五个亚家族。其中Arf亚家族包括Arf GTPase和Arf-like GTPase,而Arf-like GTPase简称为Ar1GTPase,它是多功能的调节蛋白,小G蛋白作为分子开关,结构I-IV是最保守的功能区之一,起着非常重要的作用。在杨树方面关于小G蛋白基因的报道及研究都很少,本实验通过生理功能和遗传机理等方面来研究杨树中小G蛋白基因的功能,并且为植物基因工程方面提供了非常重要的基因资源。本试验是以木本植物-杨树进行研究,通过pBIOZOL法提取杨树总RNA,设计特异性引物进行RT-PCR扩增,得到了目的基因PtAr1A1a大小为300bp,为了进一步研究基因功能,将PtAr1A1a基因构建到植物表达载体pGWB2中,利用农杆菌介导法分别对杨树和拟南芥进行转化及侵染,筛选并获得T0代转基因杨树和T2代纯合转基因拟南芥,分析研究对转基因植株后代的表现和胁迫应答方面的影响。采用200mmol/L NaCl、8%PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2和干旱等胁迫处理后,分别在2h、12h、24h时间处理的转基因杨树进行RT-PCR。结果表明,24h的PtAr1A1a-1转基因杨树在200mmol/L NaCl和200mmol/L Mannitol处理后的表达量是2h和12h的2倍,干旱胁迫的PtAr1A1a-1转基因杨树表达量,8%PEG-6000和10mmol/LH2O2胁迫处理在24h的表达量是2h、12h的0.99倍。对转基因拟南芥中GTP水解能力的测定中,在80mmol/L NaCl、8%PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2中的水解能力在75min均达到最大。结果表明,在80mmol/L NaCl中,此时A1组的水解能力是WT组中的1.19倍和PB2组中的1.39倍。在8%PEG-6000中,此时A1组的水解能力是WT组中的0.98倍和PB2组中的1.13倍。在200mmol/L Mannitol中,此时A1组的水解能力是WT组中的1.22倍和PB2组中的1.2倍。在10mmol/L H2O2中,此时A1组的水解能力是WT组中的1.01倍和PB2组中的0.9倍。再对比野生型拟南芥(WT)、pGWB2转基因拟南芥(PB2)和A1a转基因拟南芥(A1)分别在80mmol/L NaCl、8%PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/LH2O2等胁迫处理一周,来验证PtAr1A1a基因对植物的生长起到的重要作用。结果表明,WT组、PB2组、A1组三种植株鲜重的变化,在80mmol/L NaCl处理的A1组转基因拟南芥的鲜重是分别是WT组的1.35倍,PB2组的1.4倍。在8%PEG-6000处理的A1组转基因拟南芥的鲜重是分别是WT组的1.08倍,PB2组的1.21倍。在200mmol/L Mannitol处理的A1组转基因拟南芥的鲜重是分别是WT组的1.56倍,PB2组的1.41倍。在10mmol/L H2O2处理的A1组转基因拟南芥的鲜重是分别是WT组的1.01倍,PB2组的1.05倍。对转基因拟南芥中电导率的测定,对比WT组、PB2组和A1组拟南芥分别在80mmol/L NaCl、8%PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2等胁迫处理一周后,结果说明,在60mmol/LNaCl胁迫后的三组拟南芥对比,A1组受到破坏程度为36.21%,WT为58.33%,PB2组为57.23%。在8%PEG-6000中,A1组为49.27%,WT为55.76%,PB2组为51.39%。在200mmol/L Mannitol中,A1组为32.21%,WT组为52.27%,PB2组为51.89%。在10mmol/L H2O2中,A1组为49.25%,WT组为52.95%,PB2组为51.12%。对转基因拟南芥的叶绿素的测定,WT组、PB2组和A1组拟南芥分别在80mmol/L NaCl、8%PEG-6000、200mmol/L Mannitol、10mmol/L H2O2等胁迫处理一周后,结果说明,在80mmol/LNaCl中,A1组是WT组的1.45倍和PB2组的1.55倍。在8%PEG-6000中,A1组是WT组的0.95倍和PB2组的1.02倍。在200mmol/LMannitol中,A1组是WT组的1.56倍和PB2组的1.48倍。在10mmol/L H2O2中,A1组是WT组的1.03倍和PB2组的0.99倍。
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