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菌核(Sclerotium)是许多丝状真菌生活史中的一种重要的、常见的休眠结构,青霉属中的一些种能产生菌核。相对于不产菌核的青霉菌株,产菌核青霉具有一些独特的生物学特性因而表现出良好的应用前景。从山西省汾阳混交林土壤中以及山西省五台山油松根部的土壤中,本实验室分别分离得到两株能在菌核内积累类胡萝卜素的青霉PT95和Q1菌株,并对两株菌株的菌核分化和类胡萝卜素代谢进行了初步研究。在实验室的前期工作基础上,本论文用ITS方法对青霉PT95和Q1菌株进行了种的鉴定;采用传统的固体平板方法以及水平板方法,筛选有利于PT95和Q1菌株大量产生菌核的最适培养基;从氧胁迫对PT95和Q1菌株菌核分化、脂质过氧化、抗氧化代谢以及抗坏血酸-谷胱苷肽(AsA-GSH)循环的影响作用方面,研究了PT95和Q1菌株对氧胁迫的细胞响应。 首先采用水平板培养方法和传统的固体平板培养方法,分别选取9种培养基对青霉PT95和Q1菌株进行了培养,比较不同培养方法和培养基对两株菌株菌核分化、菌核生物量和类胡萝卜素含量的影响,筛选出有利于菌核生长的最适培养基。结果表明水平板方法可以进行青霉PT95和Q1菌株的培养,并能在平板表面形成菌核。两株菌在25％甘油硝酸盐琼脂(G25N)培养基和G25N液体培养基上生长非常缓慢,没有渗出液和菌核的出现。青霉PT95菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上菌核成熟的时间最短,在查氏培养基(CA)上菌核成熟的时间最长。Q1菌株在PDA和麦芽汁培养基(MEA)上菌核出现和成熟的时间最短。在水平板培养中,PT95菌株在查氏酵母膏液体培养基(CYB)、查氏液体培养基(CB)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)上菌核成熟的时间最短,Q1菌株在PDB培养基上菌核出现以及成熟的时间最早。PT95菌株的菌核形状以圆形为主,而Q1菌株的菌核多为不规则状。适合PT95菌株大量产生菌核的固体培养基和液体培养基分别是MEA、CYB,适合Q1菌株大量产生菌核的固体培养基和液体培养基分别是MEA、PDA和MEB。 运用rDNA ITS方法并结合形态学观察结果对青霉PT95和Q1菌株进行了鉴定。PT95和Q1菌株的ITS rDNA序列已提交GenBank数据库,登录号分别为KC966728(PT95)和KC966729(Q1)。PT95和Q1菌株与汤姆青霉(Penicillium thomii,登录号NR077159)的ITS基因序列相似性达到100%,因此将PT95和Q1菌株鉴定为汤姆青霉(Penicillium thomii)。 以PDA和MEA培养基作为基础培养基,分别研究了CuSO4、H2O2和百草枯导致的氧胁迫对汤姆青霉PT95和Q1菌株菌落形态、菌核分化以及菌核生物量和菌核中类胡萝卜素含量的影响。PT95和Q1菌株在添加了百草枯的培养基上没有生长。随着CuSO4和H2O2导致的氧胁迫水平的提高,两株菌株渗出液出现的时间、菌核出现的时间以及菌核成熟的时间都提前了1-3天,菌核的直径也增大了。在不同氧胁迫培养条件下,汤姆青霉PT95和Q1菌株的菌落主要由菌核组成。两株菌株的菌核生物量以及菌核中类胡萝卜素的含量与氧胁迫之间有一定的正相关性。结果说明在氧胁迫条件下,汤姆青霉PT95和Q1菌株一方面可以通过形成菌核来度过不良环境,另一方面也可在菌核中积累类胡萝卜素这种抗氧化剂来保护机体。氧胁迫程度越高,两株菌株所形成的菌核生物量也越高,菌核中积累的类胡萝卜素也越多。 以PDA和MEA培养基作为基础培养基,分别研究了CuSO4和H2O2导致的氧胁迫对汤姆青霉PT95和Q1菌株脂质过氧化及抗氧化代谢的影响,结果表明汤姆青霉PT95和Q1菌株的脂质过氧化水平与氧胁迫之间有一定的正相关性。在低氧胁迫条件下两株菌株菌核中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)这几种抗氧化酶的活力较高,GPX为主要的抗氧化酶;两株菌株菌核提取物的DPPH自由基清除能力、亚铁离子螯合能力以及还原能力等抗氧化性指标较强。说明在低氧胁迫条件下,PT95和Q1菌株主要通过产生抗氧化酶和非酶抗氧化物质来度过不良环境;而在高氧胁迫条件下,机体产生的抗氧化酶和非酶抗氧化物质不足以保护自身,就通过分化形成更多的菌核来帮助菌株度过不良环境,以期达到保护机体的目的。 通过测定AsA-GSH循环中抗坏血酸、谷胱甘肽的含量以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)的活力,研究了氧胁迫对汤姆青霉PT95和Q1菌株AsA-GSH循环的影响,结果表明氧胁迫可以提高汤姆青霉PT95和Q1菌株菌核内还原型抗坏血酸(AsA)和氧化型抗坏血酸(DHA)的含量以及AsA/DHA;在相同的氧胁迫培养条件下,菌核中的DHA含量要高于AsA含量。氧胁迫可以提高汤姆青霉PT95和Q1菌株菌核内还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,GSH/GSSG与氧胁迫之间有一定的负相关性;在相同的氧胁迫培养条件下,菌核中的GSH含量要高于GSSG含量。低氧胁迫条件下两株菌株菌核中的APX、GR活力较高,APX和GR活力与氧胁迫呈一定的负相关性。MDHAR和DHAR活力与氧胁迫呈一定的正相关性,这有利于单脱氢抗坏血酸(MDHA)和DHA被还原为AsA,可以催化AsA的再生并能保证AsA在机体组织中有较高的还原态,可以适应不良的环境。说明在低氧胁迫条件下,PT95和Q1菌株主要通过AsA-GSH循环中的APX和GR这两种抗氧化酶来度过不良环境;而在高氧胁迫条件下,PT95和Q1菌株通过AsA-GSH循环中的AsA和DHA、GSH和GSSG非酶抗氧化物质以及MDHAR、DHAR抗氧化酶来帮助菌株度过不良环境,以期达到保护机体的目的。