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稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis是水稻上的重要的两大迁飞性害虫之一,其幼虫能啃食绿叶组织导致叶片光合作用减少,最终导致产量的损失。由于其卷苞危害的特殊取食习性,常规的化学防治方法很难达到效果,通过介导嗅觉反应去控制害虫是管理有害生物的一个潜在措施。深入研究稻纵卷叶螟对环境化学因子刺激的感受机制及嗅觉相关蛋白的功能,将为稻纵卷叶螟的防治和可持续治理提供新的途径和策略。本文以稻纵卷叶螟作为研究对象,对参与化学感受机制的化学感受蛋白(Chemosensory Proteins,CSPs)以及气味受体(Odorant Receptors,ORs)的功能进行了研究分析,结果如下:(1)转录组数据分析构建稻纵卷叶螟6个主要化学感受组织转录组,包括不同性别成虫的触角、足和生殖末节。利用De novo拼接后共获得67357条unigene序列,其中有36966条序列(54.8%)能匹配到已知数据库中。最终鉴定出97个与嗅觉相关的基因,其中包括14个化学感受蛋白基因,30个气味结合蛋白基因,36个气味受体基因,15个离子型受体基因和2个感觉神经元膜蛋白基因。利用FPKM值对基因的表达谱进行分析,鉴定出多个具有性别差异或组织特异性表达的基因,为以后的稻纵卷叶螟嗅觉机制的探索提供了基础资料。(2)化学感受蛋白CSPs基因克隆及序列分析对3个CSPs(Cmed CSP1,Cmed CSP2,Cmed CSP3)进行基因克隆、蛋白质特性分析和转录水平的时空表达谱分析。结果显示3个CSPs均为酸性蛋白,存在18-23个氨基酸的信号肽,其相对分子量和等电点分别为12.5 k D,4.8;13.9 k D,6.73和14.4 k D,5.4。q PCR实验结果表明,Cmedcsp1和Cmedcsp2广泛表达在稻纵卷叶螟的触角、足和翅中,在幼虫期和蛹期几乎不表达,在成虫期表达量与性别、日龄,以及交配状态等有密切关系,且在已交配雌虫足中的表达量显著高于未交配;而Cmedcsp3特异性的表达于触角之中,且在雄虫触角中表达量显著高于雌虫。(3)Cmed CSP1的组织分布及功能分析构建了重组载体Cmed CSP1-p ET22b并在原核表达系统E.coli成功表达;随后利用离子交换层析的方法获得了无标签的Cmed CSP1重组纯蛋白。Western Blot结果显示蛋白广泛表达于各个组织触角、胸、腹、足和翅中,与基因的表达谱相一致;利用免疫胶体金技术对靶标蛋白在感器中进行定位,CSP1抗体大部分标记在雌雄触角的锥形感器,少量分布于雌虫的毛型感器中;体外结合特性分析结果显示Cmed CSP1与待测寄主挥发物有广谱的结合特性,其中与萜烯类的结合能力最强。注射Cmed CSP1-ds RNA之后稻纵卷叶螟对橙花叔醇、α-雪松烯、R-(+)-柠檬烯和侧柏烯的EAG反应显著性降低,说明Cmed CSP1可能与寄主挥发物的识别有关。(4)CSP2的组织分布及功能分析构建重组表达载体Cmed CSP2-p GEX-6p-1并在E.coli中表达成功后,利用亲和层析柱对蛋白进行纯化,利用Precission Protease切除GST标签后获得的纯蛋白用于后续试验。Western Blot结果显示Cmed CSP2在各个组织中都有一定的表达量,其与转录水平的基因表达谱相一致;免疫组织化学定位结果显示CSP2抗体标记在雌雄虫的锥形感器中;利用体外结合特性分析显示Cmed CSP2与之间的结合能力,发现Cmed CSP2与大多数水稻常见挥发物有较好的结合特性,与长链烷烃类和萜烯类均有很强的结合能力。注射了Cmed CSP2-ds RNA的稻纵卷叶螟成虫触角对长链烷烃类如十九烷、二十一烷;萜烯类物质如橙花叔醇、2-庚酮、α-雪松烯、顺-β-法尼烯和柏木脑等物质的EAG反应显著降低,说明CSP2能对寄主挥发物包括绿叶挥发物如顺-3-己烯醇、柠檬烯、2-庚酮等物质进行识别。利用同源结构模拟和分子对接的方法研究了CSP2结构与功能之间的关系,发现位于α4-螺旋的亲水性氨基酸残基Arg67和疏水性氨基酸残基Phe72均是其主要的结合位点,而C末端缺失会导致蛋白结合能力丧失。(5)Cmed CSP3的组织分布及功能分析构建重组表达载体Cmed CSP3-p GEX-6p-1并在E.coli中成功表达,利用亲和层析方法纯化重组蛋白后切除GST标签获得纯蛋白。Western Blot结果表明CSP3特异性表达于触角中,且雄虫中的表达量显著高于雌虫,与基因的表达谱相一致;利用免疫胶体金技术对靶标蛋白在感器中进行定位,结果显示CSP3抗体大部分标记在雄虫的毛形感器中,少量标记于雌虫的锥形感器;体外结合实验测定了蛋白与水稻常见挥发物之间以及稻纵卷叶螟性信息素的四种成分,Z11-16:Ac;Z13-18:Ac;Z11-16:Al和Z13-18:OH的结合能力。结果显示Cmed CSP3对配体的结合有很强的选择性,只与植物绿叶类挥发物中环己醇及萜烯类物质有较强结合能力,与其他物质的结合力都很弱或无结合能力;同时与性信息素组分Z11-16:Ac,Z11-16:Al有较强的结合能力;注射Cmed CSP3-ds RNA之后稻纵卷叶螟对长链烷烃类如二十烷,二十一烷,萜烯类物质如α-雪松烯、侧柏烯和反式石竹烯等的EAG反应显著降低;且对性信息素组分Z11-16:Ac的EAG反应显著性降低。(6)气味受体功能分析克隆了7个假定ORs的全长,其中包括气味受体辅助受体Orco和6个普通的气味受体ORs基因,预测结果显示其均含有7个跨膜结构域。对已知的ORs构建系统发育树,发现基因高度分化,分属不同的基因簇,仅Cmed OR1和Cmed OR39亲缘关系较近,属于同一支。利用爪蟾卵母细胞结合双电极电压钳对ORs的功能进行分析,仅注射Cmed OR1/Orco和Cmed OR31/Orco的细胞对Orco的特异性受体VUAA反应,说明其在细胞中正确表达。对这两个受体与寄主挥发物和性信息素组分的结合能力进行研究,仅发现Cmed OR1的唯一配体苯乙醛。这些研究结果为进一步明确稻纵卷叶螟的行为机制、开发高效环保的新型药剂及对稻纵卷叶螟进行防治和种群监控提供基础资料,也为明确CSPs和ORs在昆虫嗅觉感受中的功能以及稻纵卷叶螟的嗅觉感受机制提供了基础资料和数据支持。