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胶质母细胞瘤是颅内常见恶性肿瘤,目前临床上采用手术、放疗、化疗、生物治疗等综合治疗,但仍存在高复发率、高致残率、高病死率等问题,因此,在对人恶性脑胶质瘤的治疗研究中,寻找一种更加有效的治疗方法成为一项刻不容缓的课题。近年发现了hMena, MMPs, Rho GTPases等一系列与恶性胶质瘤细胞侵袭迁移有关的蛋白,从而认识到与恶性胶质瘤细胞侵袭性相关的骨架构筑分子蛋白、运动调控蛋白的异常表达及活性,是导致肿瘤细胞向邻近脑实质侵袭、向远隔迁移的主要原因之一。因此,抑制胶质母细胞瘤的侵袭迁移,可以立足于控制胶质瘤细胞本身的运动相关蛋白。理解恶性胶质瘤细胞在脑实质内播散及运动相关蛋白在细胞运动中的作用是治疗恶性胶质瘤的关键。绿色荧光蛋白作为一种报告蛋白为我们提供了观察胶质瘤细胞运动的标记。三维胶质瘤细胞-脑片共培养模型为我们提供了胶质瘤细胞在体内运动的环境。通过培养于脑片的胶质瘤细胞,可以追踪观察胶质瘤细胞在脑片内的运动方式。Rac1是重要肌动蛋白骨架调控蛋白,控制板状伪足的形成。Rac1激活其下游效应因子,并和这些效应因子共同转运至细胞运动前端的细胞膜下,诱导肌动蛋白骨架重组,产生片状伪足,从而促进细胞运动。有关胶质瘤侵袭迁移的体外研究的传统方法己证实,Rac1蛋白的活性与胶质瘤细胞的侵袭性密切相关。我们通过胶质瘤细胞-脑片共培养模型来验证Rac1蛋白的活性与胶质瘤细胞侵袭性的关系。课题分为二部分进行：1.建立胶质瘤细胞-脑片共培养模型。为模拟胶质瘤细胞在体内环境中的运动,我们建立了胶质瘤细胞-脑片共培养模型。首先,利用携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒感染大鼠C6胶质瘤细胞,人U251、U87、LN229、SNB19五种细胞。利用流式细胞仪筛选并计数五种荧光细胞。为使细胞更好的接种于大鼠脑片表面,将筛选后的荧光细胞分别培养成绿色荧光细胞球。第二,利用振动切片机切取3周龄SD大鼠全脑,制作400μm厚脑片并培养于Millicell插入式细胞培养皿上。连续观察脑片的形态及结构7天,碘化丙啶(PI)染色鉴定脑片神经元活性。最后,将绿色荧光细胞C6细胞球接种于脑片表面,形成胶质瘤细胞-脑片共培养模型。荧光显微镜及共聚焦显微镜观察C6细胞在脑片上的侵袭和迁移。结果：利用倒置荧光显微镜观察,5种胶质瘤细胞成功转入绿色荧光蛋白；利用流式细胞仪筛选出荧光细胞,荧光细胞比例为100%；利用慢速摇床法培养荧光细胞球,将筛选后的荧光细胞分别培养成大小约300-500μm的细胞球；SD大鼠完整全脑脑片可在体外培养成活；利用倒置显微镜观察,大鼠脑片连续培养7d后仍然保持完整的皮质、尾状核、胼胝体等组织结构,PI染色证实脑片中神经元仍保持活性；利用共聚焦激光扫描显微镜逐层扫描可见C6细胞在脑片中的侵袭及三维分布,侵袭过程中C6细胞形态保持良好。2.胶质瘤细胞在器官型脑片模型中的侵袭及抗侵袭研究。为了评估胶质瘤细胞在脑片上的迁移距离,通过倒置荧光显微镜我们测量了C6细胞不同时间在脑片上的迁移面积,利用同心圆的形式记录了迁移直径,计算出胶质瘤的迁移速率。胶质瘤细胞-脑片共培养7天后,4%多聚甲醛固定,通过共聚焦显微镜逐层扫描分析胶质瘤细胞在脑片内的侵袭深度。Rac1抑制剂NSC23766在脑片上对C6胶质瘤细胞运动的影响。实验中分二组：NSC23766处理组：将C6荧光细胞球接种于脑片表面,于温箱37℃、5%C02、饱和湿度条件下培养3小时后,利用微量加液器将1μL浓度为100μg/ml的NSC23766滴入到C6荧光细胞球接种点,连续加入七天；对照组：将C6荧光细胞球接种于脑片表面,于温箱37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养3小时后,利用微量加液器将1μL PBS滴入到C6荧光细胞球接种点,连续加入七天。7天后,4%多聚甲醛固定,共聚焦显微镜扫描成像评价不同处理组C6细胞迁移和侵袭能力的差别。Rac1活性实验和Western blotting分别检测不同处理组C6细胞中GTP-Rac1、总Rac1蛋白的表达水平。结果：荧光显微镜下观察显示C6细胞接种脑片表面后1、3、5、7天,迁移范围随时间的增加而逐渐增加,计算出C6胶质瘤细胞7天在脑片表面的平均迁移速率为11.36-15.27μm/h；与对照组(侵袭深度198.0±9.2gm)比较,NSC23766处理组(侵袭深度105.3±10.3μm)C6细胞在脑片中的侵袭能力降低(P<0.05)；与对照组(光密度值0.308±0.003)比较,NSC23766处理组(光密度值0.139±0.016)C6细胞内Rac1活性明显降低(P<0.05)；二组中总Rac1蛋白(光密度值0.862±0.023、0.817±0.030)的表达水平没有明显变化(P>0.05)；培养7天后,C6胶质瘤细胞产生了沿着白质纤维束迁移的极性。结论1.绿色荧光蛋白作为一种报告蛋白标记胶质瘤细胞,可被用于追踪胶质瘤细胞的迁移。2.胶质瘤细胞-脑片共培养模型是模拟胶质瘤细胞在体内侵袭、迁移形式以及评估抗肿瘤治疗的良好的实验模型。3.在胶质瘤细胞-脑片共培养模型中,胶质瘤细胞可以产生极性并沿白质纤维束迁移；抑制Rac1蛋白活化可以显著地抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。