肝硬化在我国为常见肝脏疾病，且发病率逐年升高。临床上一旦合并腹水、肝性脑病或食道胃底静脉曲张破裂出血等并发症，以及血清白蛋白降低、胆碱酯酶活力降低、胆红素与转氨酶升高及凝血酶原时间延长等征象，说明患者已经进入肝硬化失代偿期，若不及时治疗可能最终造成肝功能衰竭。对于失代偿期肝硬化患者，原位肝移植被认为是唯一有效的治疗手段，但因供肝严重不足、费用昂贵、围手术期风险、移植后免疫抑制剂的长期使用及移植肝肝炎等问题，限制了肝移植的广泛开展。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞。胚胎干细胞虽具有全能性(totipotency)，但因伦理问题应用受到限制。成体干细胞具有多能性（multipotency），它包括造血干细胞、神经干细胞、肝干细胞以及间充质干细胞（mesenchymal stemcells，MSCs）等。MSCs主要存在于骨髓、肝脏、脐带、外周血等中胚层间充质，具有独特的免疫调节作用、自我更新和跨胚层多向分化潜能等特点[1]。目前多采用骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived MSCs, BM-MSCs）移植治疗肝硬化已经在国内外研究机构广泛展开[2]。然而迄今为止，BM-MSCs治疗肝病尚缺乏前瞻性对照临床试验以明确其安全性和有效性；并且已经有研究显示，HBV感染患者BM-MSCs分化潜能和免疫抑制功能显著降低。近年来，脐带间充质干细胞（human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs）因其取材方便、扩增简便、无伦理学限制和病毒感染风险而备受关注，也已开始应用在临床研究。本课题设计了前瞻性对照研究以观察UC-MSCs治疗失代偿性肝硬化患者的安全性和有效性。本课题采集健康脐带组织，采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞，通过贴壁培养分离纯化MSCs，并从形态、表型、肝细胞样细胞分化潜能三方面进行鉴定；随后将UC-MSCs通过外周静脉回输给肝硬化腹水患者，对照组给予生理盐水回输，观察UC-MSCs回输对患者生化指标以及凝血机制、甲胎蛋白、血常规等的影响，测定并比较回输后两组患者的肝功、下腹腹水及终末期肝病评分模型（the model ofend-stage liver disease, MELD），评价UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的安全性及有效性；最后，通过体外实验，研究UC-MSCs是否影响肝星状细胞（hepaticstallete cells, HSCs）的活化及凋亡过程，探讨UC-MSCs治疗肝硬化的机制。研究目的通过对人UC-MSCs生物学特性的研究，建立一种分离、培养、扩增和鉴定UC-MSCs的实验方法；通过UC-MSCs外周静脉回输给肝硬化腹水患者，评价UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者随访1年的安全性及有效性，明确UC-MSCs回输治疗适应症，为进一步制定合理的临床治疗方案奠定基础；通过体外实验，检测UC-MSCs对星状细胞（LX-2）活化、凋亡效应的影响，进一步探讨UC-MSC治疗肝硬化患者腹水减少的可能机制。研究内容和方法一、分离、培养及鉴定UC-MSCs1、采用胰酶、胶原酶顺序消化法，分离培养UC-MSCs；2、倒置显微镜观察培养UC-MSC细胞的形态，应用流式细胞仪鉴定细胞表型；3、采用OSM、HGF联合bFGF的方法诱导人UC-MSCs向肝细胞样细胞分化；二、UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的临床实验1、采用前瞻性、平行对照分组法，将本中心收治的54例肝硬化腹水患者分为治疗组（38例接受UC-MSCs外周静脉回输治疗）和对照组（16例给予生理盐水回输），两组均同时行综合内科治疗；2、观察两组患者回输术后临床症状、不良反应及并发症情况；3、测定并比较不同时间点两组的生化指标以及AFP、WBC、PA；腹部B超检测并比较两组患者下腹腹水变化情况以及MELD评分。三、UC-MSCs影响星状细胞（LX-2）活化及凋亡水平的体外检测1、星状细胞的CFSE掺入；2、星状细胞与不同浓度UC-MSCs的混合培养；3、流式细胞仪检测星状细胞表达的α-SMA平均荧光密度值，及表达凋亡标记分子annexin V和7-AAD的LX-2的细胞比例。研究结果一、分离、培养及鉴定UC-MSCs1、从人脐带中成功分离纯化得到MSCs；2、细胞呈纤维状，表达CD44、CD105、CD73、CD90，不表达CD34、CD45、CD31以及HLA-DR等分子；3、在细胞因子作用下，UC-MSC可被诱导分化为卵圆形肝细胞样细胞。二、UC-MSCs回输治疗失代偿期肝硬化患者的临床实验1、UC-MSCs回输治疗后，除个别患者体温有自限性升高外，无其它不良反应；治疗组与对照组的原发性肝癌发生率无明显统计学差异（P>0.05）；UC-MSCs回输对患者的相关生化指标等均无明显影响；2、在回输后，大多数患者的乏力、纳差、腹胀、失眠等症状均不同程度改善；3、治疗组与对照组的ALT、TBIL、CHE以及MELD评分均无明显统计学差异（P>0.05），但UC-MSCs治疗患者在治疗36周后血浆ALB显著升高、下腹腹水量显著减少（P <0.05）。三、UC-MSCs影响星状细胞活化及凋亡水平的体外检测1、UC-MSCs以剂量依赖的方式抑制星状细胞的活化，并且抑制效应的产生不直接依赖于细胞之间的相互接触，而依赖于细胞因子的分泌；2、UC-MSCs以剂量依赖的方式促进星状细胞的凋亡，最大可促进LX2凋亡达2倍以上，并且其促进凋亡同样不依赖于细胞之间的相互接触，而依赖于细胞因子的分泌。结论1、采用胰酶、胶原酶顺序消化法从人脐带中成功分离纯化得到MSCs，且分离细胞在体外可诱导为肝细胞样细胞，从而建立一种分离、培养、扩增和鉴定UC-MSCs的实验方法；2、人UC-MSCs治疗失代偿期肝硬化患者安全性好，能改善患者的临床症状和肝功能，升高白蛋白水平，减少腹水生成，对临床上顽固性腹水及低蛋白状态患者具有良好的应用前景；3、UC-MSCs回输不仅可改善低蛋白血症，而且因旁分泌机制为主的多种治疗作用，提高了肝细胞合成、代谢、灭活功能，并且通过调节星状细胞的活性及凋亡，可潜在降低肝窦门脉压力，从而减少腹水形成及预防食管胃底静脉曲张出血；4、UC-MSCs治疗失代偿肝硬化安全性好、可显著升高血浆白蛋白、减少腹水，可成为一种新的治疗失代偿性肝硬化的临床选择；大样本、多中心、随机、双盲、对照研究将进一步明确uc-msc的长期疗效。