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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性疾病,其主要病理表现为增生性滑膜炎。RA疾病分布全球,其主要病理特征包括多种滑膜细胞增生、内衬层的增厚、炎性细胞浸润,软骨和骨组织的破坏,并最终导致关节畸形和功能丧失,是导致患者工作能力丧失和残疾的主要原因之一。虽然很多研究者对细胞因子和其他炎症介质在RA发病中的作用做了大量研究,但RA的发病机制尚不完全清楚。研究报道异常活化的T细胞在RA病理机制中起关键作用,同时分化的T细胞亚群在RA中也存在失衡。其中,Th17细胞分泌高水平的IL-17,加速RA的发生发展。胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis,CIA)是一种免疫炎性RA动物模型,因为该模型有许多组织学和免疫学特征与RA相似,所以CIA是筛选和研究治疗RA药物比较理想的动物模型。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(代号CP-25)是芍药苷衍生的新型活性单体。课题组前期研究显示CP-25能够通过调节免疫应答而抑制大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)、小鼠CIA的继发炎症。艾拉莫德(Iguratimod)是具有免疫调节活性的环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制药,临床用于治疗成人活动性RA。艾拉莫德对大鼠CIA有明显的抗炎作用及关节滑膜保护作用,其机制可能与下调致炎因子IL-1、IL-1β、TNF-α水平有关。本研究拟在通过建立大鼠CIA模型的基础上,研究CP-25对大鼠CIA的治疗作用以及对活化T细胞亚群和分化T细胞亚群的调节作用。目的1.观察CP-25对大鼠CIA的治疗作用;2.研究CP-25对CIA大鼠外周血单核细胞(peripheral blood monouclear cellsPBMC)和脾脏中T细胞亚群的影响。方法1.Wistar雄性大鼠CIA模型的建立及分组。将鸡Ⅱ型胶原(CⅡ)与弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant,FCA)充分乳化,制成CⅡ乳剂。第0天,于皮内注射0.2 ml CⅡ乳剂,建立大鼠CIA模型。将所有大鼠随机分成正常组(Normal group),模型组(CIA group),CP-25组(CP-25 group),艾拉莫德组(Iguratimod group)等四组,每组有10只大鼠。除正常对照组以外,其他三组均建立大鼠CIA模型。给予CP-25(50mg/kg)治疗,艾拉莫德(Iguratimod)(10mg/kg)作为阳性对照药。2.CIA大鼠进行整体指标的检测和评价。通过使用电子天平测定大鼠体重,足趾容积测量仪(山东医学科学院)测量足爪容积,检测CIA大鼠关节肿胀数、关节炎指数、全身炎症评分等整体指标,分析CP-25对CIA大鼠的治疗作用。脾脏和关节组织HE染色并在显微镜下观察病理学,对相关指标进行评分,进而分析CP-25对CIA大鼠炎症变化的影响。3.CCK-8法、ELISA法、细胞流式术分析T和B细胞增殖能力、细胞因子和T细胞亚群。CCK-8试剂盒(cell counting kit,CCK-8)检测CIA大鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞的增殖能力及CP-25对增殖变化的影响。运用细胞流式术分析CIA大鼠外周血活化T细胞亚群在炎症不同阶段的百分比变化(CD3+T细胞、CD3+CD4+辅助型T细胞(helper T cell,Th cell)、CD3+CD4+CD25+活化的Th细胞),脾脏中T细胞分化亚群的百分含量(CD4+INF-γ+Th1细胞、CD4+IL-4+Th2细胞、CD4+IL-17+Th17细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞)以及CP-25对其变化的影响。使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CIA大鼠外周血清中炎症因子IL-4、IL-17的水平变化分析CP-25对T细胞亚群的调控作用。4.体外实验分析CP-25对人外周血T淋巴细胞中IL-17、STAT3、p-STAT3表达情况的影响。用细胞刺激剂(佛波酯和离子霉素)刺激人PBMC后,多功能酶标仪在波长为450nm下检测不同组淋巴细胞的OD值来分析IL-17对淋巴细胞的影响以及CP-25的作用。用CD4+IL-17A+标记人PBMC的T淋巴细胞。使用荧光二抗间接标记人PBMC的T淋巴细胞中的STAT3、p-STAT3,通过流式细胞术检测其表达以及CP-25对IL-17、STAT3、p-STAT3表达的影响。5.实验所得的相关数据采用SPSS16.0软件进行统计分析。所有计量资料皆以两组采用t检验进行比较,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),实验数据均数±标准差(Mean±Standard Error of Mean,X±SD)表示,利用Graph Pad Prism 5.0软件进行实验数据相关图形的绘制,P<0.05被认为是有差异性显著,具有统计学意义。结果1.CP-25对大鼠CIA有治疗作用CIA大鼠体重明显下降,足爪容积增加,足爪肿胀数、关节炎指数、全身炎症评分显著增加。CP-25(50mg/kg)可以恢复下降的CIA大鼠体重,降低CIA大鼠足爪容积,降低CIA大鼠的足爪肿胀数、关节炎指数、全身炎症评分;2.CP-25能够降低CIA大鼠胸腺、脾脏指数,抑制T、B淋巴细胞增殖反应,改善脾脏和踝关节病理变化CIA大鼠的胸腺、脾脏指数上升,T细胞和B细胞增殖反应明显,CIA模型组大鼠脾脏淋巴滤泡增生,红髓淤血,白髓生发中心增多;CIA模型组大鼠踝关节的滑膜组织中滑膜细胞增生明显,炎性细胞浸润及血管翳形成,软骨组织破坏。CP-25(50mg/kg)可以下降胸腺、脾脏指数,抑制T细胞和B细胞的增殖反应,缓解CIA大鼠脾脏和踝关节的病理变化;3.CP-25通过调节T细胞来治疗大鼠CIACIA大鼠的CD3+T细胞,CD3+CD4+T细胞,CD3+CD4+CD25+T细胞亚群,Th1、Th2和Th17细胞的比率明显升高,CP-25(50mg/kg)可以有效下调上述细胞的百分含量。4.CP-25可以降低经细胞刺激剂(佛波酯和离子霉素)刺激后人外周血T淋巴细胞中的IL-17、STAT3、p-STAT3的表达。细胞刺激剂刺激后,人PBMC的淋巴细胞增殖反应明显,T淋巴细胞中的IL-17、STAT3、p-STAT3的表达增加,CP-25可以抑制经刺激的细胞增殖反应,降低T淋巴细胞中的IL-17、STAT3、p-STAT3的表达。结论1.CP-25对大鼠CIA有治疗作用;2.CP-25对大鼠CIA有治疗作用可能与调节活化T细胞亚群和分化T细胞亚群有关;3.CP-25可能通过调节IL-17/STAT3/p-STAT3信号通路影响T细胞功能;4.CP-25对治疗RA具有潜在的前景。