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背景目的子宫内膜癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,近年来的发病率呈上升趋势。虽然大多数的患者在诊断时处于疾病的早期阶段,但是仍有一些特殊类型的子宫内膜癌比较具有侵略性,部分的晚期患者会在常规治疗后出现复发,而这些患者预后差的原因主要是化疗耐药。肿瘤细胞的耐药性和肿瘤干细胞有关。肿瘤干细胞是指肿瘤组织内一群能够自我更新并促进肿瘤生长的细胞。SPARC相关钙粘连分子 2(SPARC related modular calcium binding 2,SMOC-2)基因编码的蛋白是一种细胞外分泌蛋白,在小鼠的性腺和生殖系统发育过程中起到了关键的作用。SMOC-2是新近鉴定的肠道干细胞相关的细胞外分泌蛋白。本研究通过体内外实验,分析SMOC-2与子宫内膜癌肿瘤干细胞的关系,以探究SMOC-2影响肿瘤干细胞促进子宫内膜癌细胞增殖和耐药的分子机制。研究方法1.利用免疫组化法检测子宫内膜癌组织芯片中SMOC-2的表达量以及SMOC-2表达和临床病理参数之间的关系。2.利用siRNA或SMOC-2质粒干扰或过表达SMOC-2,在体内外检测SMOC-2对子宫内膜癌细胞增殖和化疗抵抗的影响。3.用流式细胞术和肿瘤细胞体外成球实验分离出子宫内膜癌肿瘤干细胞和非干细胞,并比较两组细胞中SMOC-2的mRNA和蛋白表达水平。干扰SMOC-2后检测子宫内膜癌细胞的成球能力,收集成球细胞用qPCR检测肿瘤干细胞相关基因SOX2,OCT4和NANOG的表达量是否有变化。利用免疫组化法检测SMOC-2在子宫内膜癌组织中的表达与子宫内膜癌肿瘤干细胞标记物CD133,CD44的表达是否有一致性。4.利用荧光素酶报告基因筛选SMOC-2可能激活的信号通路。5.利用免疫荧光法,Western blotting法和信号通路特异性抑制剂进一步验证SMOC-2 激活了 WNT/β-catenin 信号通路。6.利用免疫共沉淀和免疫沉淀共培养检测SMOC-2激活WNT/β-catenin信号通路的具体分子机制。研究结果1.免疫组化的结果显示,和正常子宫内膜组织比,SMOC-2在子宫内膜癌组织中高表达,高表达率为73.25%,而且SMOC-2的高表达与组织学病理分型,病理分级和肿瘤肌层浸润深度有关。2.在体外实验中,干扰SMOC-2能增加接触抑制的敏感性,抑制子宫内膜癌细胞增殖。相反的,过表达SMOC-2能减弱接触抑制的敏感性,促进子宫内膜癌细胞的增殖。干扰SMOC-2能增加子宫内膜癌细胞对紫杉醇和顺铂的药物敏感性,细胞存活率明显低于对照组。在体内实验中,干扰SMOC-2能明显抑制肿瘤的生长和增加顺铂对瘤体的抑制率。3.SMOC-2的mRNA和蛋白表达量在CD133+/CD44+细胞中,即肿瘤干细胞中高于CD133-/CD44-细胞,即非肿瘤干细胞。在成球实验获取的肿瘤干细胞中SMOC-2的mRNA表达量高于普通培养的子宫内膜癌细胞。特异性干扰SMOC-2能减弱子宫内膜癌细胞的成球能力,肿瘤干细胞相关的基因SOX2,OCT4和NANOG的表达量也下调。SMOC-2在子宫内膜癌组织中的表达和子宫内膜癌肿瘤干细胞标记物CD133和CD44的表达呈正相关。4.荧光素酶报告基因的结果为干扰SMOC-2会抑制WNT/β-catenin通路,过表达 SMOC-2 能激活 WNT/β-catenin。干扰 SMOC-2 后 WNT/β-catenin 通路下游靶基因的表达量也下调。免疫荧光和Western blotting的结果显示,过表达SMOC-2能促进β-catenin入细胞核。5.SMOC-2能直接作用于Wnt通路的受体Fzd6和LRP6并促进配体和受体(Wnt3a和Wnt10b)之间的结合。研究结论1.SMOC-2能促进子宫内膜癌细胞的增殖和耐药。2.SMOC-2是子宫内膜癌肿瘤干细胞特征基因。3.SMOC-2在子宫内膜癌中激活WNT/β-catenin通路,促进β-catenin入核。4.SMOC-2直接和WNT/β-catenin通路的受体Fzd6和LRP6相互作用,并促进配体和受体之间的相互作用。5.SMOC-2有可能成为靶向肿瘤干细胞以治疗子宫内膜癌的新方法。