糖尿病(diabetes mellitus，DM)是发达国家CKD的首位原因，并且随着T2DM和肥胖发病率的增加已快速成为发展中国家CKD的主要原因。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是DM最严重和最常见的一种微血管并发症，是DM致死的重要原因。DN是一个进展性疾病，患者一旦出现持续性蛋白尿，其肾功能将不可遏制地进行性下降。据统计，约25％的患者在6年内，50％的患者在10年内，75％的患者在15年内发展为终末期肾病，需要替代治疗。而目前尚缺乏有效治疗手段来阻抑DN的进展，当前治疗主要以控制血糖、血压，抑制RAAS系统，调节血脂为主，但仅仅起到延缓病情进展的作用。因此，深入研究DN早期发病机制、积极寻求早期干预其进展的方法已成为当今糖尿病和肾脏病学界十分紧迫的研究课题。　　 过去大多研究认为DN的主要病理特征是肾小球细胞外基质堆积、系膜增宽、基底膜增厚、肾小球硬化及肾间质纤维化。然而，这些因素仅能解释30％～50％的尿蛋白排泄率和肾小球滤过率的变化。近年来，人们把注意力放在足细胞上。足细胞(脏层上皮细胞)是高度分化，结构复杂，定位特殊的细胞，位于肾小球基底膜的最外侧，足突间形成裂孔隔膜是滤过膜的最后一道屏障。Kriz等研究证实在糖尿病肾病病程中当系膜细胞和内皮细胞尚未改变时就可出现足细胞数量减少，从而提示足细胞减少是糖尿病肾病早期最敏感的指标之一。足细胞损伤在DN发病中的作用逐渐得到重视，足细胞形态、功能和数目的异常均可引起蛋白尿并最终导致肾功能损害。因此，从足细胞的角度来探讨DN的发病机制也显得尤为必要和重要。　　 随着对DN早期足细胞损伤机制的深入研究发现裂孔隔膜(SD)上的重要蛋白nephrin表达下降，进而导致足细胞的足突融合，蛋白尿增加。Nephrin是肾小球裂孔隔膜上第一个被确定的蛋白成分，也是目前为止认为最重要的。对糖尿病患者和动物模型的研究发现，高糖环境下肾小球足细胞nephrin表达减少，尿蛋白排泄增加，提示DN发病可能与nephrin表达下调而增加GBM通透性和基质沉积有关。高糖环境下，体内的葡萄糖与蛋白质氨基发生非酶糖化反应，经过一系列脱水、氧化及重排，生成糖基化终末产物(advancedglycation end products，AGEs)。Wendt等学者对培养的人足细胞观察发现，AGEs与足细胞表面的糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation endproducts，RAGE)结合，直接抑制nephrin mRNA的合成，使其表达减少。综上所述，长期的高血糖引起的代谢紊乱可能是DN发病的根本原因，高糖血症是导致糖尿病大血管和微血管并发症发生发展的主要因素。尽管如此，在实验动物模型中nephrin的表达和定位与糖尿病肾病的关系尚不统一。这可能与种属差异，糖尿病病程以及是否伴有高血压有关。因此，纠正足细胞裂孔隔膜上nephrin的表达是DN治疗的新方向。　　 过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一类配体(ligands)依赖性转录因子，属于核受体超家族。目前已发现PPARs有三种亚型：α、β/δ和γ，三者的表达方式、配体结合的特异性以及在代谢方面的作用均有所不同。与其他核受体家族成员相似，PPARα在靶细胞核内与9-顺视黄酸受体(RXR)形成异二聚体，PPARα的配体通过激活该二聚体，使之结合到靶基因启动子区域的过氧化物酶体增殖物反应元件(PPRE)上，从而调节靶基因的转录。最近公布结果的FIELD(The FenofibrateIntervention and Event Lowering in Diabetes)研究表明，通过对来自3个国家63个中心的9795例T2DM患者长达5年的非诺贝特治疗可以显著减少T2DM患者的白蛋白尿。　　 非诺贝特改善糖尿病肾病的机制尚不清楚，间接的调节代谢作用和直接的肾脏作用都参与其中。已经明确肾小球足细胞nephrin基因启动子区域存在PPRE，也就是说PPARα激动剂可以直接调控nephrin的基因转录。另外有学者发现PPARα激动剂可以通过两种机制来上调人类胚胎肾上皮细胞及足细胞中nephrin表达，但都是在正常培养条件下进行的干预研究。　　 尽管如此，上述研究大多来源于人体和动物模型，直接研究非诺贝特作用于体外培养的足细胞的实验很少，因此本研究模拟体内高糖环境，观察不同时间点高糖对足细胞形态及nephrin蛋白表达的影响，并通过不同浓度的非诺贝特作用于高糖培养的足细胞，观察其对nephrin表达的影响，来探讨非诺贝特调脂作用之外直接保护糖尿病肾病大鼠足细胞的机制。另外，本研究试图建立一种重复性好、操作简便的大鼠足细胞培养方法，为研究糖尿病肾脏疾病的机制及药物保护作用建立一个实验平台。　　 第1章大鼠肾小球足细胞原代培养及鉴定方法的研究　　 研究目的：建立一种重复性好、操作简便的大鼠足细胞原代培养方法。　　 材料与方法：取重量200-220g的正常雌性SD大鼠，无菌取肾后通过差异过筛法分别通过80目、150目及200目细胞筛网，收集200目筛网上肾小球进行接种，利用植块法将接种培养面向上放置，4.5h后将培养瓶翻转过来正常放置于37℃、5％CO2的恒温恒湿培养箱进行孵育。采用形态学观察和细胞间接免疫荧光技术，对足细胞进行鉴定，并用流式细胞仪进行足细胞纯度分析。　　 结果：5d后可见绝大部分肾小球贴壁并有少许肾小球周围有细胞爬出，7-8d可见所有肾小球周围有大量细胞爬出，胰酶消化后传代培养。形态学及特异性抗体WT-1，nephrin鉴定为足细胞。流式细胞仪分析细胞纯度99％左右。　　 结论：三层筛网法分离大鼠肾小球，利用植块法促进肾小球贴壁，方法简单、高效，培养的原代足细胞具备足细胞生物学特性，且在操作简单的情况下细胞产量与国外文献报道的相当。　　 第2章非诺贝特对高糖培养的大鼠肾小球足细胞nephrin表达的影响　　 研究目的　　 探讨不同时间点高糖环境对大鼠足细胞形态及nephrin表达的影响，以及非诺贝特干预后对nephrin的作用，旨在为研究非诺贝特保护糖尿病肾病大鼠的机制提供实验基础和理论依据。　　 材料与方法　　 SD大鼠原代足细胞的培养：参见第1章。以下实验所选细胞皆为首次传代后生长第7天完全分化的足细胞。　　 1.不同时间点高糖对足细胞形态及nephrin表达的影响：将足细胞按2.0×105/瓶接种于25 cm2培养瓶，在正常糖浓度培养基中培养至完全分化状态，然后用无血清培养基培养24h使各组细胞生长同步化。然后分别更换为正常糖浓度、甘露醇对照组、高糖组培养基，各组培养基中FBS的终浓度为20％，并置于培养箱内培养。分别于12h、24h和48h观察各组细胞形态变化及提取细胞蛋白，WB法检测各个时间点不同组nephrin的表达水平。　　 2.不同浓度非诺贝特对高糖培养的足细胞nephrin表达的影响：分组之前的处理同第1步，然后分别更换为正常糖浓度、甘露醇对照组、高糖组、高糖+DMSO组、高糖+Feno50μmol/L组、高糖+Feno100μmol/L组、高糖+Feno200μmol/L组，作用48h，提取各组细胞蛋白，WB法检测nephrin的表达水平。　　 结果：　　 1.倒置相差显微镜下观察正常糖及甘露醇对照组足细胞分化良好，呈星形，细胞体和细胞核较增殖状态显著增大，自细胞体伸出明显的树枝样突起，相邻细胞间形成连接。高糖组12h、24h、48h都出现足突回缩，部分足突消失及失去细胞间连接，以48h最明显。NIS-element图像分析结果显示：高糖组12h时足细胞面积增大(P＜0.05)，24h最明显(P＜0.05)，48h足细胞面积减小(P＜0.05)。WB结果示12h、24h高糖组nephrin表达量高于正常组及甘露醇对照组(P＜0.05)，而48h高糖组nephrin表达量低于正常组及甘露醇对照组(P＜0.05)，三个时间点高糖组两两比较均有显著性差异。　　 2.非诺贝特作用48h后，倒置相差显微镜下观察50μmol/L组及100μmol/L组均可以恢复高糖环境下足细胞的面积至正常水平，增加足细胞nephrin表达(P＜0.05)，但是200μmol/L组反而加重足细胞的损伤，减少nephrin的表达(P＜0.05)。　　 结论：　　 1.高糖作用12h、24h使足细胞面积显著增大，足突回缩，48h使足细胞面积显著缩小。12h、24h足细胞nephrin表达量显著增加，48h显著降低。　　 2.50μmol/L及100μmol/L非诺贝特均能恢复高糖培养的足细胞的正常形态，上调足细胞nephrin表达量，但是大剂量200μmol/L反而有抑制作用。