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干扰素（Interferon,IFN）系统是机体抗病毒免疫的重要组成部分。干扰素通过激活Janus激酶（Janus Kinases,JAK）和信号转导和转录激活子（Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT）信号通路,诱导下游干扰素刺激基因（Interferon-stimulated gene,ISG）表达,从而发挥抗病毒免疫效应。黏病毒抵抗蛋白（Myxovirusresistance,Mx）是一种重要的干扰素刺激基因,也是干扰素产生的重要标志。目前,对脊椎动物干扰素系统的研究比较深入,已经鉴定出多种ISG以及活化STATs蛋白质抑制剂（Protein inhibitor of activated STAT,PIAS）,但在无脊椎动物中鲜有报道。本文以长牡蛎（Crassostrea gigas）为研究对象,采用基因克隆、原核表达及RNA干扰（RNA interference,RNAi）等研究方法,鉴定了CgMx1和CgPIAS分子,旨在解析其在长牡蛎抗病毒免疫过程中发挥的调节作用。研究结果如下:1.在长牡蛎中鉴定出一个CgMx1和一个CgPIAS分子,它们均在血淋巴细胞中高表达。从长牡蛎中克隆鉴定到一个CgMx1和一个CgPIAS基因,其开放阅读框分别为1689和1887 bp,编码分别含有562和628个氨基酸的多肽,预测分子量大小分别为63.87和68.2 k Da,等电点分别为9.01和8.65。CgMx1蛋白含有一个N末端的动态GTP酶结构域。该结构域由三个GTP结合基序（GDXXSGKS,DLPG和T/NKXD）组成,在C端含有一个特殊的亮氨酸基序（L505、L512和L561）。系统进化分析发现其与无脊椎动物盘状鲍鱼（Haliotis discus discus）亲缘关系较近。CgPIAS蛋白具有相对保守的SAP、PINP和靠近C端的锌指结构域MIZ。系统进化分析发现CgPIAS与无脊椎动物的PIAS蛋白亲缘关系较近,与厚壳贻贝的PIAS3聚为一支。CgMx1和CgPIAS m RNA在长牡蛎多个组织中均有表达。CgMx1 m RNA在血淋巴细胞的表达水平较高（为唇瓣中的1342.45倍,p<0.001）,CgMx1蛋白主要分布在血淋巴细胞的细胞质和细胞核中。CgPIAS m RNA在血淋巴细胞中表达量较高,是外套膜中的32.98倍（p<0.001）,其次在鳃和唇瓣中的表达量也相对较高,分别是外套膜中的20.32和14.83倍（p<0.001）,在其他组织中的表达量则相对较低。2.CgMx1参与CgIFNLP介导的抗病毒免疫应答。利用qRT-PCR和western blot检测了poly（I:C）和重组长牡蛎类干扰素蛋白（recombinant IFN-like protein,r CgIFNLP）刺激后血淋巴细胞中CgMx1的表达情况,结果显示CgMx1的表达量均显著升高,分别在刺激后的6 h和24 h处达到最高表达量（为对照组的13.14和66.28倍,p<0.05）。其中r CgIFNLP刺激24 h后,CgMx1蛋白的表达量高于其对照组。利用RNAi技术分别干扰了CgIFNLP和CgSTAT的表达,其表达水平均显著降低分别为对照组的0.31和0.50倍（p<0.05）。血淋巴细胞中CgMx1的表达量在poly（I:C）处理CgIFNLP和CgSTAT被干扰的牡蛎12 h后均显著下降,分别是对照组的0.02和0.04倍（p<0.001）。凝胶迁移实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）结果显示重组CgSTAT（r CgSTAT）蛋白可以直接结合CgMx1启动子中的干扰素刺激反应元件（Interferon-stimulated response element,ISRE）和伽马干扰素激活位点（Gamma interferon activation site,GAS）,表明CgSTAT可以启动CgMx1的表达。据以上结果表明CgMx1通过CgIFNLP和CgSTAT介导的信号通路参与长牡蛎抗病毒免疫应答。3.CgPIAS通过JAK/STAT信号通路介导长牡蛎类干扰素系统的抗病毒免疫应答。使用poly（I:C）、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）和rCgIFNLP分别刺激长牡蛎后,血淋巴细胞中CgPIAS的m RNA表达量均呈现出先升高后下降再升高的趋势。在poly（I:C）刺激组,血淋巴细胞中CgPIAS m RNA的表达量在刺激48h后高表达,是对照组的7.38倍（p<0.001）。在灿烂弧菌刺激组,CgPIAS表达量在刺激72 h后高表达,是对照组的12.43倍（p<0.01）。r CgIFNLP刺激后,CgPIAS m RNA的表达量在24 h显著升高,是对照组的13.08倍（p<0.01）。利用生物膜干涉技术验证了重组CgPIAS-MIZ蛋白可以与重组CgSTAT蛋白相互作用,两者结合的KD值为3.88×10-8M。采用RNAi技术干扰CgPIAS的表达后,其表达量显著下降是对照组的0.074倍（p<0.01）,使用poly（I:C）处理CgPIAS被干扰的牡蛎,6 h后检测到血淋巴细胞中的寡聚腺苷酸合成酶类蛋白（Oligoadenylate synthetase like,OASL）表达量显著上升,是对照组的15.8倍（p<0.05）;CgMx1和病毒抑制蛋白（Virus inhibitory protein,Viperin）的表达量也上升,分别为对照组的1.05和1.35倍（p>0.05）,差异不显著。综上所述,在长牡蛎中鉴定出结构域较为保守的CgMx1和CgPIAS分子,它们在血淋巴细胞中表达量较高,均能响应poly（I:C）等刺激。CgMx1通过CgIFNLP介导的JAK/STAT信号途径参与长牡蛎抗病毒免疫反应,而CgPIAS则通过与CgSTAT结合负调控JAK/STAT信号通路,进而参与长牡蛎类干扰素系统介导的抗病毒免疫应答。研究结果为深入了解长牡蛎类干扰素系统的信号传递途径奠定了重要基础,并为认识干扰素系统的进化提供了借鉴意义。