研究背景特发性肺间质纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)近年来发病率和死亡率均居高不下,发病后平均生存3-5年,临床治疗效果差,激素和免疫抑制剂已经通过循证医学证实效果不佳1-5。目前肺间质纤维化发病机理仍不清楚,可能与肺成纤维细胞过度增生及肺泡上皮细胞凋亡失衡有关,病理提示肺间质纤维化病人存在严重的成纤维细胞增殖和细胞外基质增生,由于这些原因导致肺组织僵硬,顺应性下降,病人呼吸做功增加。要治疗肺间质纤维化,就需要减少肺部成纤维细胞增生及降解细胞外基质,恢复肺组织顺应性,目前仅有吡非尼酮(pirfenidone)和尼达尼布(nintedanib)能延缓病情发展,吡非尼酮主要作用抑制TGF-β 1对成纤维细胞肌性转化,尼达尼布主要作用抑制成纤维细胞增生,但临床实践发现临床效果不确切,急需新的治疗方法解决特发肺间质纤维化的治疗问题1-5,16-18。成纤维细胞具有分化为肌成纤维细胞的能力,肌成纤维细胞是一种特殊的收缩细胞,可合成大量的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),肌成纤维细胞(myofibroblasts)在正常的伤口愈合中起着重要的作用。然而,在纤维化疾病中,细胞凋亡并不是正常代谢过程的一部分,这导致ECM的过度积累、组织功能紊乱,正常组织被瘢痕组织取代。肌成纤维细胞在肺内的聚集与肺体积的减少和症状的严重程度发展呈正相关。TGF-β 1(Tumor-transforming growth factor betal)被认为是促进正常伤口愈合和组织纤维化的主要介质,研究表明,Smad3是人肺成纤维细胞TGF-β 1增强收缩的关键,而通过Smad3信号转导的TGF-β 1诱导的α-平滑肌肌动蛋白(α-5mooth muscle actin,α-SMA)表达也是收缩的关键。肌成纤维细胞以α-SMA的表达为特征,被广泛认为参与了这些过程,说明了 α-SMA的表达对胶原凝胶收缩的重要性,α-SMA已被证实与成纤维细胞收缩和组织重塑有关,而成纤维细胞收缩和组织重塑参与了正常伤口愈合和纤维坏死。TGF-β 1激活成纤维细胞表达间充质标记物α-SMA和胶原蛋白分泌到细胞外基质中。TGF-β 1表达和肌成纤维细胞激活的程度与疾病进展高度相关。拮抗TGF-β 1可显著抑制胶原蛋白沉积和牙龈纤维化。此外,研究表明,TGF-β 1通过刺激成纤维细胞中α-SMA的表达来诱导成纤维细胞的转变,不断促进纤维化的形成。因此,减少α-SMA和胶原蛋白的产生是治疗特发性肺间质纤维化的重要因素 7,9-13,15。博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化和IPF患者的纤维母细胞中Fas表达减少,与HDAC2(histone deacetylase 2)和 HDAC4(histone deacetylase 4)的表达增加有关。IPF患者的纤维母细胞有抗凋亡的现象,特别是Fas所介导的凋亡。组蛋白修饰在纤维母细胞抗凋亡中起着至关重要的作用15,TGF-β 1诱导的肌成纤维细胞分化是依赖于HDAC4激活的AKT信号通路实现的,曲古霉素 A(trichostatin A,TSA)、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoy-lanilide hydroxamic acid,SAHA)、spA(Spiruchostatin A)能抑制 TGF-β1所诱导的肌成纤维细胞的分化,最终使α-SMA、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ的表达和可溶型胶原蛋白的释放减少,同时TSA能使AKT去磷酸化19。TGF-β 1诱导的肌成纤维细胞分化产生大量胶原和纤连蛋白,导致ECM的积累,从而通过刺激肌成纤维细胞分化诱导气道重构。研究中,逆转了 TGF-β1对RNA和蛋白表达水平的影响。组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDAC)的平衡通过修饰核心组蛋白或非组蛋白前体来调控基因表达和细胞功能。与高乙酰化组蛋白相关的DNA区域通常被积极转录。HDACs使组蛋白去乙酰化产生致密的染色质,不利于转录。非组蛋白乙酰化可影响其稳定性、蛋白-蛋白相互作用、定位或DNA结合能力。HDACs已被证明参与各种器官的ECM生产。在小鼠中,与HDAC2相关的核蛋白Hop过表达可导致心脏间质纤维化,而HDAC抑制剂可逆转这种纤维化。研究发现,IPF患者肺内的环氧化酶(cyclooxygenase 2,COX-2)表达减少,HDAC可能通过引起组蛋白去乙酰化减少COX-2的表达。同时发现,HDAC可能通过组蛋白去乙酰化F-IPF中的IP-10表达下降19。之前的研究中表明,HDAC2在TGF-β 1诱导的鼻息肉成纤维细胞中表达增加,通过抑制鼻息肉器官培养中HDAC2等表达以及组蛋白的高乙酰化作用,抑制了 TGF-β 1诱导的肌成纤维细胞分化和ECM的产生7-11,13-14。表观基因学研究的证据表明,组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的激活是调节基因表达和细胞增殖所必需的。组蛋白乙酰化时,染色体打开容许转录因子及mRNA合成酶结合到转录位点增加转录和表达,相反组蛋白去乙酰化时,染色体恢复紧密状态,减少基因转录。HDACs是一组酶,催化组蛋白和一些与细胞增殖相关的非组蛋白(如酪氨酸激酶和转录因子3(STAT3))中赖氨酸残基去乙酰化。在哺乳动物中,有18个HDAC,它们被分成四类。第Ⅰ类HDACs包括HDAC1、2、3、8;第 Ⅱ 类 HDACs 包括 HDAC4、5、6、7、9、10;第Ⅲ类 HDACs 称为 sirtuins;第四类HDAC是HDAC11。在HDACs中,HDAC1和HDAC2被报道需要胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞的器官发育和增殖。HDAC抑制剂,如trichostatin A(TSA),可以抑制Ⅰ类和Ⅱ类HDACs的活性,并有效地抑制细胞周期进展以及多种细胞类型的细胞增殖。最近的研究表明,SK-7041是Ⅰ类HDACs的选择性抑制剂,其抗增殖作用与Ⅰ/Ⅱ类HDAC抑制剂相似,这表明Ⅰ类HDACs在纤维化的进展中起主导作用。目前去乙酰化酶HDAC在医学基础研究应用较多,尤其是在肿瘤和纤维化方面包括肺间质纤维化,心肌纤维化,肝纤维化和肾小球纤维化方面应用较多。并且有研究表明,几乎所有Ⅰ类和Ⅱ类HDAC酶在IPF肺组织中均有过表达和上调19,20。实验室应用siRNA基因沉默法在正常肺成纤维细胞沉默HDAC2 mRNA,其行为表现为金属基质酶增加,增生下降6。然而,目前仍缺乏HDAC2在人肺成纤维细胞中功能调节作用的研究。在人肺成纤维细胞增生及肌性转化过程中,HDAC2细胞表达水平如何变化?应用基因沉默法沉默HDAC2,是否会可能改变肺成纤维细胞功能?以上都是本课题研究的目的。组蛋白去乙酰化酶2在肺成纤维细胞中功能调节的作用研究目的:1.明确人肺成纤维细胞培养成功。2.确定TGF-β 1刺激人肺成纤维细胞后,应用Western blot法测定HDAC2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达量情况。3.使用Endofectin-Max向人肺成纤维细胞中转染小干扰RNA,确定HDAC2 siRNA特异性转染人肺成纤维细胞是否能沉默HDAC2。4.探究组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)对人肺成纤维细胞活化增殖的影响作用。研究方法标本来源:取胸外科手术过程中周边正常肺组织体积约20mm*20mm,60岁男性,肺内小结节手术病人,既往无慢性病史,吸烟史20年,吸烟指数400,无工业毒物接触史,(活检标本保存于无血清DMEM冰敷或4℃),收集标本进行原代人肺成纤维细胞培养;实验步骤:第2～4代人肺成纤维细胞进行实验,应用TGF-β 1进行刺激48小时,应用Western blot技术进行检测HDAC2及α-SMA表达量;继续实验,使用Endofectin-Max向人肺成纤维细胞中转染小干扰RNA HDAC2(siRNA-HDAC2)24小时后,应用Western blot法测定HDAC2的表达情况;应用HDAC2 siRNA特异性转染人肺成纤维细胞后,2组细胞分别传代培养24小时,再次应用不同浓度TGF-β 1进行刺激细胞48小时,应用Western blot技术进行检测α-SMA表达量。观察HDAC2对人肺成纤维细胞增殖的影响。结果:1.自行培养人肺成纤维细胞,经波形蛋白免疫细胞化学染色证实波形蛋白(Vimentin)染色可见视野内细胞几乎均呈阳性表达。本研究采用成人周边正常肺组织块贴壁法培养肺组织成纤维细胞,经鉴定细胞原代培养成功(见附图1)。2.a-SMA是肌成纤维细胞分化的标志,应用TGF-β 1刺激人肺成纤维细胞后,应用Western blot法测定HDAC2和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达量均明显增加,从图2可以看出,对照组HDAC2细胞表达水平较低(Mean=1),TGF-β 1组HDAC2细胞表达水平较高(Mean=1.74519),差异具有统计学意义(P<0.05);从图3可以看出,对照组α-SMA细胞表达水平较低(Mean=1),TGF-β 1组α-SMA细胞表达水平较高(Mean=3.17678),差异具有统计学意义(P<0.05)。3.转染人肺成纤维细胞siRNA-HDAC2组HDAC2和α-SMA的蛋白表达明显下降从图4可以看出,对照组HDAC2细胞表达水平较高(Mean=1),HDAC2 siRNA组HDAC2细胞表达水平较低(Mean=0.438732),差异具有统计学意义(P<0.05)。从图5可以看出对照组α-SMA细胞表达水平较高,对照组α-SMA表达水平分别为TGF-β 1 浓度 Omol/L 组(Mean=1)、TGF-β 1 浓度 50mol/L 组(Mean=1.95305)、TGF-β 1 浓度 100mol/L 组(Mean=2.47244);HDAC2 siRNA 组α-SMA 细胞表达水平较低,对照组α-SMA表达水平分别为TGF-β 1浓度Omol/L组(Mean=0.788312)、TGF-β 1 浓度 50mol/L 组(Mean=1.46341)、TGF-β 1 浓度100mol/L 组(Mean=2.14431);差异具有统计学意义(P<0.05)。4.通过以上研究,证实转染siRNA-HDAC2明显抑制人肺成纤维细胞的增殖活性(具体图示见附图)。结论:人肺成纤维细胞存在HDAC2表达增加,应用靶向基因沉默法沉默HDAC2,可明显减少α-SMA表达,两者成正相关关系,HDAC2、α-SMA表达与肺成纤维细胞增殖和细胞外基质增生有着密切关系,提示HDAC2表达增加参与了肺成纤维细胞增殖和细胞外基质增生的发病机制,表明靶向沉默HDAC2可抑制人肺成纤维细胞活化增殖,提示其在特发性肺纤维化中可能发挥调控作用,进一步深入研究,可为临床治疗特发性肺间质纤维化提供新的治疗靶点。