【摘 要】
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在生物学研究中应用非常广泛,与传统的ZFN以及TALEN技术相比,CRISPR/Cas9技术具有易操作,耗时少,高效等一系列优点,迅速发展成为主流的基因定点编辑技术。在sgRNA的引导下,Cas9核酸酶可在基因组DNA特定位置上制造双链断裂（DSB）,细胞修复DNA双链断裂时会引入不同长度的插入/缺失突变（Indels）。真核生物的染色体是由核小体组成的,核小体
【基金项目】
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国家自然科学基金（31872809）；
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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在生物学研究中应用非常广泛,与传统的ZFN以及TALEN技术相比,CRISPR/Cas9技术具有易操作,耗时少,高效等一系列优点,迅速发展成为主流的基因定点编辑技术。在sgRNA的引导下,Cas9核酸酶可在基因组DNA特定位置上制造双链断裂（DSB）,细胞修复DNA双链断裂时会引入不同长度的插入/缺失突变（Indels）。真核生物的染色体是由核小体组成的,核小体通过进一步组织和压缩形成了染色体的高级结构,在基因组上一些染色体区域呈现高度疏松的结构,这些结构被称为开放染色质（Open Chromatin）。开放染色质调控很多重要的生物学活动:基因转录,DNA复制,细胞分化等,很多染色体上的生物学特征如转录因子的结合对于染色体的开放性有重要的作用。不同的Cas9靶点区域对应的染色质开放程度千差万别,染色质的结构很可能会通过阻止Cas9核酸酶的可及性来影响CRISPR/Cas9系统的基因组编辑作用。目前应用CRISPR/Cas9技术一个非常关键的限制因素是在一些靶点的Indel频率低,增加了在细胞中进行基因敲除以及构建带有基因变异细胞模型的难度。因此开发一种高编辑效率的Cas9变体能在很大程度上缓解这一困境。我们首先在前列腺癌风险SNP位点rs339331附近选择靶点,在前列腺癌细胞里针对该靶点进行Cas9基因组编辑,当rs339331位点为T时的基因组编辑效率大于C,并且T等位基因的染色质开放程度大于C。雄激素DHT处理后增加了 rs339331位点的染色质开放程度,同时也提高了该靶点的基因组编辑效率,说明染色质开放状态的提高能促进Cas9的基因组编辑。通过检测22Rv1,BT474和HeLa这3种细胞中9个sgRNA靶点区域的染色质开放状态与基因组编辑效率,发现在不同细胞系中染色质的开放状态与Cas9的基因组编辑效率高度相关。接下来我们在Lenti-X 293T 细胞中的 HOXB13、EMX1、DYRK1A 和 B3GALNT2 基因上设计30个sgRNA靶点,发现这30个sgRNA靶点上的基因组编辑效率与FAIRE富集倍数高度相关。最后我们在Cas9蛋白的氨基端或羧基末端融合不同数量的VP64,得到 Cas9-ADs,选择 Lenti-X293T 细胞的 DYRK1A-T1 靶点,发现 Cas9-ADs通过提高靶点区域的染色质开放状态来提高基因组编辑效率。在另外15个靶点上,Cas9-ADs与Cas9相比能提高基因组编辑效率。本研究揭示了染色质的开放状态是影响哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9基因组编辑效率的关键因素,将Cas9核酸酶与转录激活域VP64融合通过提高靶点区域的染色质开放程度来改善Cas9核酸酶的基因组编辑,开发了一种名为“Cas9-ADs”的工具。可通过增加Cas9核酸酶对染色质的可及性显著改善基因组编辑效率。
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