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第一部分乳腺癌干细胞在乏氧微环境中积累大量糖原目的:乏氧是在乳腺癌微环境中的常见现象,我们前期研究乳腺癌干细胞在乏氧环境中大量增殖,但潜在的机制仍然不清楚。鉴于乏氧肿瘤微环境中糖原合成增加,以及乳腺癌干细胞更倾向于驻留在乏氧肿瘤微环境中,因此我们猜测乳腺癌干细胞是否具有独特的糖原代谢模式呢?我们以基于生物力学原理的三维纤维蛋白软凝胶（3D fibrin）筛选培养的肿瘤再生细胞（TRCs）为肿瘤干细胞模型,探究乏氧乳腺癌TRCs中糖原水平。方法:（1）通过生物信息学方法分析糖原生成相关酶表达与乳腺癌预后之间的相关性;（2）通过高碘酸-雪夫（PAS）染色检测MCF-7、T47D和SUM159刚性培养皿细胞（Bulk）和TRCs中糖原的表达;（3）运用糖原检测试剂盒检测MCF-7、T47D和SUM159刚性培养皿细胞（Bulk）和TRCs中糖原的含量;（4）通过透射电子显微镜观察MCF-7、T47D和SUM159刚性培养皿细胞（Bulk）和TRCs中糖原的含量;（5）运用上述三种检测方法,体内检测裸鼠乳腺癌ALDH1+TRCs中糖原水平。结果:（1）糖原生成相关酶葡萄糖磷酸变位酶1（PGM1）、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶2（UGP2）和糖原合酶1（GYS1）表达越高,乳腺癌患者预后越差,生存期越短;（2）体外实验证明糖原大量积累在乏氧状态下的人乳腺癌TRCs中,而不是普通分化的肿瘤细胞中;（3）体内实验证明乳腺癌ALDH1+TRCs中糖原的含量很高,大量的糖原积累在乏氧的乳腺癌TRCs中。结论:糖原生成相关酶表达与乳腺癌预后相关,且相较于已分化的乳腺癌细胞,乏氧的乳腺癌干细胞中糖原含量增加。第二部分乏氧激活糖异生介导的糖原代谢通路对乳腺肿瘤再生细胞生长的影响及机制目的:葡萄糖-6-磷酸（G6P）是糖原代谢通路中的核心代谢产物,在乳腺癌TRCs的来源和去路如何?此部分主要探究乏氧的乳腺癌TRCs中糖原生成G6P的来源及糖原分解产生的G6P的去路,并探究乏氧激活的糖异生-糖原合成-糖原分解-PPP代谢链对乳腺癌TRCs生长的影响及机制。方法:（1）通过13C-葡萄糖示踪的方法检测乏氧条件下Bulk和TRCs中M+6糖原的变化;（2）利用Real-time PCR和Western blot的方法检测乏氧条件下Bulk和TRCs中己糖激酶2（HK2）的表达;（3）运用Real-time PCR和Western blot检测常氧和乏氧状态下Bulk和TRCs中糖异生关键酶PCK1、FBP1和G6pase的表达;（4）用不同浓度3-MPA（一种PCK1抑制剂）处理MCF-7 TRCs或者PCK1 siRNA转染MCF-7 TRCs,采用糖原检测试剂盒检测糖原含量;（5）13C-丙酮酸、13C-乙酸、13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺来处理乏氧乳腺癌TRCs,LC-MS检测M+2或M+3 PEP的比例;（6）用不同浓度3-MPA或者PCK1 siRNA阻断糖异生,13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺标记,LC-MS检测乏氧乳腺癌TRCs中M+2或M+3 PEP的相对比例;（7）13C-丙酮酸、13C-乙酸或13C-谷氨酰胺标记,LC-MS检测M+2 G6P/G1P或M+3 G6P/G1P的相对比例;（8）Real-time PCR和Western blot检测常氧和乏氧状态下Bulk和TRCs中糖原磷酸化酶（PYGL）、糖原脱支酶（GDE）和葡萄糖磷酸变位酶（PGM1）的表达;（9）MCF-7或SUM159细胞用GPI处理或PYGL siRNA阻断糖原分解途径,显微镜拍照统计克隆大小;（10）用不同浓度GPI或者PYGL siRNA阻断糖原分解途径,13C-葡萄糖标记,LC-MS检测M+2 G6P/G1P或M+2 R5P的相对比例;（11）用不同浓度6AN或G6PD siRNA阻断PPP,糖原检测试剂盒检测乏氧乳腺癌TRCs糖原含量;（12）用不同浓度6AN或G6PD siRNA阻断PPP,13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺标记,LC-MS检测M+2 R5P或M+3 R5P的相对比例;（13）通过Real-time PCR和Western blot的方法检测乏氧状态下的MCF-7或SUM159 Bulk或TRCs中PPP关键酶G6PD和PGD的表达水平;（14）乏氧状态下的MCF-7 TRCs用含13C-丙酮酸培养基一直培养5天,GPI处理后LC-MS检测M+2糖原和M+2 R5P的变化;（15）在乏氧状态下,用DNCB或BSO处理MCF-7 TRCs,显微镜拍照统计克隆大小,并用流式细胞仪检测细胞内ROS的水平;（16）分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测乏氧MCF-7或SUM159 Bulk或TRCs细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;（17）G6PD siRNA转染MCF-7或SUM159 TRCs,显微镜拍照统计克隆大小,并运用NADPH试剂盒检测细胞内NADPH/NADP+比值,LC/MS检测GSH/GSSG的比值,用流式细胞仪检测细胞内ROS的水平;（18）G6PD siRNA转染MCF-7 TRCs,并用乙醇-GSH处理,显微镜拍照统计克隆大小;（19）PYGL siRNA转染乏氧MCF-7 TRCs,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,并用流式细胞仪检测细胞内ROS的水平;（20）PCK1 siRNA转染乏氧MCF-7 TRCs,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,并用流式细胞仪检测细胞内ROS的水平;（21）PCK1过表达质粒转染MCF-7 TRCs,显微镜拍照统计克隆大小,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,以及通过流式细胞仪检测细胞内ROS的水平。结果:（1）乏氧乳腺癌Bulk和TRCs中M+6糖原没有差异;（2）乏氧乳腺癌TRCs中HK2表达下调;（3）乏氧乳腺癌TRCs中PCK1及FBP1表达显著上调,G6pase不表达;（4）阻断糖异生途径导致乏氧TRCs中糖原含量显著降低;（5）13C-丙酮酸、13C-乙酸、13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺标记,乏氧乳腺癌TRCs中M+2或M+3 PEP的比例上升;（6）阻断糖异生途径导致乏氧TRCs中M+2或M+3 PEP的比例下降;（7）13C-丙酮酸、13C-乙酸或13C-谷氨酰胺标记,乏氧TRCs中M+2 G6P/G1P或M+3 G6P/G1P的比例上升;（8）乏氧乳腺癌TRCs中PYGL、GDE和PGM1的表达显著上调;（9）阻断糖原分解途径后乏氧乳腺癌TRCs克隆体积明显变小;（10）阻断糖原分解途径后,13C-葡萄糖标记的M+2G6P/G1P或M+2 R5P的相对比例下降;（11）阻断PPP途径会导致乏氧乳腺癌TRCs中糖原积累以及M+2 R5P的比例显著降低;（12）阻断PPP,13C-葡萄糖或13C-谷氨酰胺标记,M+2 R5P或M+3 R5P的相对比例下降;（13）乏氧乳腺癌TRCs中PPP关键酶G6PD和PGD表达上调;（14）乏氧状态下的MCF-7 TRCs用含13C-丙酮酸培养基一直培养5天,GPI处理后糖原中13C标记的M+2葡萄糖从3%增加到13%,M+2 R5P从35%减少到25%;（15）用DNCB处理MCF-7TRCs,克隆大小差异不大,ROS轻微上升,用BSO处理MCF-7 TRCs,克隆体积明显变小,ROS显著上升;（16）乏氧MCF-7或SUM159 TRCs细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值上升;（17）阻断PPP途径后,乏氧乳腺癌TRCs的克隆体积明显变小,细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值下降,ROS水平上升;（18）阻断PPP途径后,乏氧乳腺癌TRCs克隆体积变小,乙醇-GSH处理后克隆体积回复;（19）阻断糖原分解途径后,乏氧乳腺癌TRCs的克隆体积明显变小,细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值下降,ROS水平上升;（20）阻断糖异生途径后,乏氧乳腺癌TRCs的克隆体积明显变小,细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值下降,ROS水平上升;（21）PCK1过表达后,乏氧乳腺癌TRCs的克隆体积明显变大,细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值上升,ROS水平下降。结论:乏氧的乳腺癌TRCs利用糖异生途径进行糖原生成,并通过糖原合成-糖原分解-PPP途径调节ROS的水平,使ROS维持在适度的水平以促进乏氧TRCs的生长。第三部分乏氧激活糖异生关键酶PCK1上调表达的机制目的:探究乏氧上调糖异生关键酶PCK1表达的机制。方法:（1）Western blot检测MCF-7 TRCs中敲低或过表达HIF-1α后PCK1的表达;（2）染色质免疫共沉淀（Ch IP）-PCR分析PCK1的启动子区域与HIF-1α或FoxO1的结合;（3）双萤光素酶报告基因检测HIF-1α或FoxO1与PCK1之间的调控关系;（4）通过Real-time PCR、Western blot和免疫荧光检测FoxO1在乏氧TRCs中的表达;（5）Western blot检测MCF-7 TRCs中敲除或过表达FoxO1后PCK1的表达;（6）在常氧和乏氧的条件下检测PCK1启动子区域的甲基化状态;（7）Western blot检测常氧和乏氧条件下Bulk和TRCs中H3K27me3和H3K4me3的表达;（8）Ch IP-PCR检测乏氧条件下Bulk和TRCs中PCK1启动子区域与H3K27me3或H3K4me3的结合。结果:（1）MCF-7 TRCs中HIF-1α敲除后PCK1的表达下降,HIF-1α过表达后PCK1的表达上升;（2）HIF-1α直接与PCK1启动子区域结合,FoxO1直接与PCK1启动子区域结合;（3）PCK1启动子萤光素酶测定显示,敲除HIF-1α或FoxO1降低萤光素酶的活性,过表达HIF-1α或FoxO1升高萤光素酶活性;（4）乏氧乳腺癌TRCs中FoxO1表达上调并且入核增加;（5）MCF-7 TRCs中FoxO1敲除后PCK1的表达下降,FoxO1过表达后PCK1的表达上升;（6）常氧和乏氧条件下乳腺癌Bulk和TRCs中PCK1启动子区域甲基化没有差异;（7）乏氧乳腺癌TRCs中H3K27me3表达下调,H3K4me3表达上调;（8）乏氧乳腺癌TRCs PCK1启动子区域中,H3K27me3结合减少,H3K4me3结合增加。结论:HIF-1α和FoxO1正向调节乳腺癌TRCs中PCK1的表达,表观遗传组蛋白甲基化修饰也参与调节PCK1的表达。第四部分PCK1作为靶点抑制体内乳腺癌肿瘤生长及增强紫杉醇治疗三阴性乳腺癌效果目的:为了进一步在体内探究乏氧激活乳腺癌TRCs的糖原代谢通路以及PCK1作为靶点对乳腺癌肿瘤生长的影响;三阴性乳腺癌（TNBC）由于其特殊表型目前尚无有效治疗手段,我们探究PCK1是否可以作为靶点与化疗药物紫杉醇联合治疗TNBC。方法:（1）裸鼠乳腺垫接种MCF-7后,舒尼替尼处理构建乏氧模型,取肿瘤组织ALDH试剂盒分选ALDH+和ALDH-肿瘤细胞,Real-time PCR检测ALDH1+TRCs糖异生、糖原代谢和PPP的关键酶的表达,包括PCK1、FBP1、G6pase、UGP2、GYS1、PYGL、G6PD和PGD;（2）分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测ALDH1+TRCs内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值;（3）免疫荧光染色检测两组肿瘤组织中Ki67的增殖情况;（4）通过LC-MS检测肿瘤组织ALDH1+TRCs糖异生、糖原代谢和PPP中间代谢产物G6P、PEP和R5P的相对含量;（5）裸鼠乳腺垫接种PCK1稳定敲除细胞系,舒尼替尼处理构建乏氧模型,分离肿瘤组织,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,并流式检测ROS的变化;（6）3-MPA灌胃乳腺垫接种MCF-7 TRCs的裸鼠,分离肿瘤组织,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,并流式检测ROS的变化;（7）裸鼠乳腺垫接种PCK1过表达稳定细胞系,分离肿瘤组织,分别运用NADPH试剂盒和LC/MS检测细胞内NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值,并流式检测ROS的变化;（8）免疫组织化学染色分析54个临床乳腺癌患者样本中PCK1的表达及与Ki67的关系;（9）生信分析乳腺癌患者PCK1的表达与生存期的关系;（10）MCF-7和SUM159细胞接种于裸鼠乳腺垫,紫杉醇（PTX）进行治疗,运用18F-FMISO PET/CT对小鼠肿瘤成像;（11）MCF-7和SUM159细胞接种于裸鼠乳腺垫,紫杉醇（PTX）进行治疗,运用H＆E染色观察肿瘤血管内皮;（12）3-MPA,GPI或6AN和紫杉醇联合处理乏氧SUM159 TRCs,流式检测凋亡和ROS水平;（13）裸鼠乳腺垫接种SUM159 TRCs,腹腔注射PTX或灌胃3-MPA或联合治疗,持续4周,期间监测肿瘤生长,通过H＆E染色和18F-FDG PET-CT成像分析肺部肿瘤转移,并检测小鼠生存期;（14）上述SUM1593-MPA和紫杉醇联合治疗模型,取肿瘤组织分离的细胞重新种植到3D纤维蛋白软凝胶中,通过显微镜拍照分析TRCs克隆大小和数目;（15）上述联合治疗模型中分离的肿瘤细胞使用Real-time PCR检测干性基因表达水平。结果:（1）体内乳腺癌ALDH1+TRCs糖异生、糖原代谢和PPP的关键酶的表达上升;（2）体内乳腺癌ALDH1+TRCs中NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值上升;（3）体内乳腺癌ALDH1+TRCs增殖旺盛;（4）体内乳腺癌ALDH1+TRCs糖异生、糖原代谢和PPP中间代谢产物G6P、PEP和R5P的相对含量增加;（5）敲除PCK1抑制体内MCF-7乳腺癌肿瘤的生长,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值下降,ROS水平上升;（6）3-MPA治疗抑制体内MCF-7乳腺癌肿瘤的生长,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值下降,ROS水平上升;（7）PCK1过表达加速体内MCF-7乳腺癌肿瘤的生长,NADPH/NADP+和GSH/GSSG的比值上升,ROS水平下降;（8）临床乳腺癌标本免疫组化分析PCK1表达显示,PCK1在晚期肿瘤中表达升高,并且与活跃的肿瘤细胞增殖相关;（9）生信分析显示乳腺癌中PCK1表达越高,患者生存期越短;（10）SUM159 TNBC肿瘤比MCF-7肿瘤更乏氧,紫杉醇治疗可加剧SUM159肿瘤乏氧;（11）紫杉醇导致SUM159肿瘤的血管内皮损伤;（12）3-MPA、GPI或6AN和紫杉醇联合诱导乏氧SUM159 TRCs的凋亡,并且伴随着ROS水平升高;（13）体内3-MPA和紫杉醇联合治疗有效抑制SUM159肿瘤生长,减少肺部转移并延长生存期;（14）体内3-MPA和紫杉醇联合治疗导致体外克隆大小和数目明显减少;（15）体内3-MPA和紫杉醇联合治疗导致TRCs干性基因明显下调。结论:体内乳腺癌ALDH1+TRCs在乏氧环境下糖异生、糖原代谢和PPP途径更强,代谢流动增强,拥有更强的抗氧化体系,与体外结果一致,并且通过3-MPA以及敲除PCK1后小鼠乳腺癌肿瘤生长明显受到抑制,过表达PCK1小鼠乳腺肿瘤生长变快。体外和体内实验均证明了3-MPA和紫杉醇联合用药可有效杀死乏氧乳腺癌TRCs,并且延缓肿瘤生长、减少肺部转移和延长小鼠生存期。说明PCK1可作为靶点抑制体内乳腺癌肿瘤生长及增强紫杉醇治疗三阴性乳腺癌效果。