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目前，各种病害的频发已经成为制约我国三疣梭子蟹养殖业健康发展的重要因素。因此，对三疣梭子蟹免疫系统的研究将有助于在疾病的防治、预防、品种选育及三疣梭子蟹免疫抗病机理等领域的研究和阐明具有重要意义和价值。 Toll样受体是一种重要的模式识别受体，在脊椎动物以及无脊椎动物先天性抗感染免疫中发挥重要作用。本研究采用同源克隆和RACE技术首次从三疣梭子蟹鳃组织中获得 Pt-Toll的cDNA全长，并利用半定量及实时荧光定量PCR技术对 Pt-Toll在各组织中的分布及表达水平进行了分析；同时在不同温度(18℃、30℃)、盐度(16‰、32‰)条件下，以及在溶藻弧菌、假丝酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，利用实时荧光定量 PCR方法检测 Pt-Toll在三疣梭子蟹鳃组织和血淋巴中 mRNA水平的表达变化；体外构建 Pt-Toll胞外结构域序列原核表达载体 pEASY?-E1-Pt Toll，并在大肠杆菌 BL21(DE3)中表达该蛋白；利用大量原核表达的外源蛋白乳化制备抗原，免疫注射小鼠并获得抗血清，蛋白免疫印迹显示所得到的抗血清能够与抗原发生特异性结合。实验主要研究成果如下： 1.同源克隆和RACE技术获得三疣梭子蟹 Toll样受体基因 cDNA序列全长，同源性分析表明，Pt-Toll与拟穴青蟹 SpToll、中华绒螯蟹 EsToll1的同源性最高，其次为凡纳滨对虾 LvToll2等虾类，与黑腹果蝇 DmToll等物种的亲缘关系相对较远。三疣梭子蟹 Toll样受体具典型的TLR跨膜蛋白结构：富含13个亮氨酸重复序列的胞外区、跨膜区、含典型 TIR结构域的胞内区。 2.半定量和实时荧光定量 PCR结果发现，Pt-Toll基因在三疣梭子蟹的鳃、心脏、肌肉、血淋巴、肠道5个组织中都有表达，其中鳃组织中的表达量最高，步足肌和心脏中表达量相对较低。 3.实时荧光定量 PCR结果显示，Pt-Toll在不同温度(18℃、30℃)胁迫条件下鳃组织中的表达水平无显著差异；在不同盐度(16‰、32‰)胁迫条件下鳃组织中 Pt-Toll的相对表达水平也无显著性差异，说明三疣梭子蟹 Pt-Toll对温度和盐度的胁迫刺激不敏感。 4.实时荧光定量 PCR结果显示，Pt-Toll在溶藻弧菌、假丝酵母菌、WSSV和LPS的免疫刺激下，仅 WSSV试验组在鳃组织中的表达水平差异不明显，其他各组在鳃组织和血淋巴中的表达水平均表现显著或极显著上调，推测 Pt-Toll可能参与三疣梭子蟹抗感染免疫过程。 5.成功构建 pEASY?-E1-Pt Toll胞外结构域原核表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)在37℃，250 r，0.3 mM IPTG的诱导条件下成功高效表达了三疣梭子蟹 Toll样受体胞外结构域融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE分析显示该蛋白大小约为87.18 kD，与预期蛋白大小吻合。通过制备抗原免疫小鼠成功诱导表达并获得该抗原的多克隆抗体，为 Pt-Toll的功能研究奠定基础。