乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的一种传染性疾病。根据世界卫生组织的报道,全球约有2.4亿的乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原阳性持续至少6个月),每年有超过68.8万人死于慢性乙肝的并发症,包括肝癌和肝硬化。乙肝疫苗的应用虽能预防乙型肝炎病毒的传播,但对于乙型肝炎的治疗仍然面临诸多问题。一般认为,彻底清除宿主细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是治愈乙肝的标准,然而目前常用的各种抗病毒疗法均未能实现这一目的。最近出现的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9系统,因可以对任何物种基因组进行DNA的定点编辑且较先前的基因编辑技术更为简单、快捷、高效,已为诸多难以实现根治的病毒性感染、遗传病以及染色体缺陷等疾病的治疗带来了曙光。截至目前,包括本课题组在内的前期研究均已成功利用CRISPR-Cas9系统在HBV细胞模型及HBV高压水动力小鼠模型中实现了对HBV复制与表达的高效抑制,从理论上证明了CRISPR-Cas9在清除乙肝病毒感染上的巨大应用价值。然而在对于相比以上模型更接近临床患者的体内模型HBV转基因小鼠来说,已有的方法均未取得明显的效果,主要是由于缺乏高效安全的基因转运载体。目前广泛使用的CRISPR-Cas9系统为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-SpCas9,这种CRISPR-SpCas9系统虽能利用慢病毒或腺病毒作为基因转运载体,但这些载体病毒过高的免疫原性及易整合至宿主细胞基因组等缺陷大大限制了CRISPR-Cas9技术在基因治疗上的应用。新型重组腺相关病毒载体(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)虽然被认为是最理想的基因治疗载体,但CRISPR-Cas9系统中的SpCas9及必需控制元件的体积(7kbp)超过了rAAV的容量(4.5kbp),并不能利用rAAV包装完整的CRISPR-Cas9系统。2015年5月,美国麻省理工大学的张峰实验室发现了一种小型化的产自金黄色葡萄球菌的CRISPR-SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)系统,并成功利用rAAV介导该系统在体内对相应基因进行编辑。本次研究旨在利用重组腺相关病毒(rAAV)介导CRISPR-SaCas9系统(rAAV::CRISPR-SaCas9)实现对HBV转基因小鼠体内HBV的复制与表达的高效抑制。同时进一步探究rAAV8::CRISPR-SaCas9系统在HBV转基因小鼠体内抑制HBV复制与表达过程中的有效剂量、持续时间、抑制效果、对HBV DNA的剪切效率、脱靶效应以及对动物可能造成的相关损伤等方面的问题。1.筛选适用于CRISPR-SaCas9系统的高效HBV靶点本课题组在前期的研究中成功利用CRISPR-SpCas9抑制了HBV细胞模型及HBV高压水动力小鼠模型中HBV的复制与表达。然而,与CRISPR-SpCas9靶点需要的PAM限制基序“NGG”不同,CRISPR-SaCas9靶点需要的PAM基序为“NNGRRT”。在缺乏gRNA靶点预测工具的情况下,我们需要对靶向HBV的靶点进行设计筛选。(1)建立新的HBV靶点设计方法为了得到适用于不同HBV基因型的SaCas9高效靶点,我们首先选取了26种不同基因型不同地区来源的HBV(A-G),并对这些不同类型HBV的基因组进行序列比对。再利用Vector NTI Advance 11.5.1软件在高度保守基因区域的正负双链查找出含PAM基序“NNGRRT”的位点。通过以上步骤,我们共找到21个符合要求的靶点。(2)靶向HBV高效靶点的筛选我们根据筛选出的靶点分别构建了21套相应的CRISPR-SaCas9表达载体,并将这些载体与含有HBV基因组的表达载体共转入293T细胞中,通过对细胞上清中的HBV抗原及HBV DNA的含量的检测及细胞活性的测定,分别评估带有不同靶点的CRISPR-SaCas9系统对HBV的抑制效率及对细胞活性的影响。经过上述筛选,我们得到了对HBV抑制效率最高且对细胞活性没有影响的gRNASa4系统。此外我们通过T7EI酶切证实了含有该系统对细胞内HBV DNA的剪切。2.利用rAAV8::CRISPR-SaCas9系统高效抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制与表达(1)利用VIII型重组腺相关病毒包装CRISPR-SaCas9系统不同血清型别的腺相关病毒具有不同的组织嗜性,其中VIII型重组腺相关病毒(rAAV8)可以特异地感染肝组织,对其他组织脏器的感染效率较低。为尽可能减少CRISPR-SaCas9系统对小鼠体内其他器官的影响,本研究选择VIII型重组腺相关病毒(rAAV8)对CRISPR-SaCas9系统进行包装。我们通过向HEK293细胞中同时转染CRISPR-SaCas9表达载体、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper,成功将带有高效靶向HBV靶点的CRISPR-SaCas9系统包装入rAAV8病毒中。用氯仿纯化法提纯收集到的病毒,根据点杂交实验结果,纯化后的病毒滴度达1×1012v.g./mL以上。(2)HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制的评估经DNA测序及血清学检测,本研究所用的HBV转基因小鼠体内整合有1.28倍HBV全长基因组,血清中HBsAg的含量达到4,000-6,000 IU/m L,HBe Ag的含量达到800-1,000 S/CO,HBV DNA含量超过108v.g./m L,并且可以在肝组织中检测到HBcAg的表达。(3)低剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9的抑制效果评估根据已有文献,我们首先测试了低剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒(5×1010v.g./只)对4-6周龄雄性HBV转基因小鼠体内HBV的抑制效果。通过对病毒复制和表达的各项指标进行连续的监测结果显示,该剂量的rAAV8::CRISPRSaCas9病毒并不能有效抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制和表达。(4)高剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9抑制了小鼠体内的HBV的复制与表达在我们将rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒剂量提高至2×1011v.g./只后,实验组小鼠血清中HBV标志物的含量出现持续下降:在连续两次注射后的第38天,实验组小鼠血清中HBsAg、HBe Ag的含量相比对照组分别下降62.96±7.59%和65.18±3.08%;血清中HBV DNA的含量相比对照组下降92.82±3.67%;通过对肝脏切片HBcAg免疫荧光结果的分析,我们发现全景扫描照片可以看出实验组HBcAg的荧光强度显著低于对照组,实验组肝组织中HBcAg的含量相比对照组下降76.88±18.39%,;通过肝组织病理学检测,我们在对照组小鼠肝组织中观察到了明显的炎性浸润和肝细胞肿大,然而实验组小鼠肝组织中却未观察到相应的炎性病理改变。通过T7EI酶切以及深度测序,我们证实了rAAV8::CRISPR-SaCas9对HBV转基因小鼠肝脏中HBV基因组相应区域的剪切作用。此外,小鼠其他脏器的病理学检测均未出现任何病理改变。本次研究也未能检测到rAAV8::CRISPR-SaCas9的脱靶效应。综上所述,我们筛选出了适用于小型化CRISPR-SaCas9系统的HBV高效靶点,并首次利用CRISPR-SaCas9系统实现了对HBV转基因小鼠体内HBV DNA复制与表达的高效抑制。本次研究扩展了CRISPR-Cas9技术在抗病毒领域的应用范围,也为今后利用CRISPR-Cas9基因编辑技术开展慢性乙肝的基因治疗提供理论依据和技术支持。