论文部分内容阅读
目的:胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然目前对胃癌采取了多手段的综合治疗,且生存率较以往有所提高,但仍无大的治疗突破。其难以治愈的原因之一与肿瘤的免疫逃逸有关。人体的抗肿瘤免疫是以T细胞介导的细胞免疫为主,T细胞的活化需双信号刺激:第一信号由T细胞抗原受体(TCR)与抗原提呈细胞(APC)上的抗原肽MHC分子复合物结合提供,第二信号由APC上的共刺激分子与T细胞上的相应配体提供,只有双信号共同刺激才能有效激活特异性的T细胞,完成细胞免疫,消灭肿瘤细胞。大量研究证实肿瘤细胞可通过缺乏共刺激分子的方式逃避机体免疫。4-1BB和4-1BBL是CD28/B7之外的另一对重要的协同刺激信号,在免疫应答、肿瘤免疫和自身免疫性疾病中起重要作用。4-1BB主要表达于活化的T细胞表面,主要以CD8+ T细胞为主,亦可表达于单核细胞,粒细胞及树突状(DC)等细胞上。4-1BB分子还诱导表达在T细胞性肿瘤细胞株上,在肝癌细胞和上皮细胞等非淋巴细胞上也有一定的表达。4-1BBL属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员,主要表达于活化的B细胞和T细胞、单核细胞、树突状细胞(DC)、神经母细胞瘤细胞及一些肿瘤细胞上。4-1BB/4-1BBL在细胞间相互作用、细胞粘附、抗原递呈、T细胞共刺激以及信号传导中起不同的作用。4-1BB和其配体4-1BBL介导的共刺激信号是激发有效的抗肿瘤细胞免疫应答尤其是长期抗肿瘤效应所必需的,有望为肿瘤生物治疗开拓新的途径。本研究采用RT-PCR测定四种不同分化程度的人胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)中4-1BB、4-1BBL的mRNA表达;采用免疫细胞化学法测定上述四种人胃癌细胞株中4-1BB、4-1BBL的蛋白表达;采用MTT法测定人淋巴细胞对上述四种人胃癌细胞株的体外杀伤活性,同时ELISA法检测人淋巴细胞与胃癌细胞共培养的上清液中淋巴因子TNF-α、IL-2、IL-10的含量变化,探讨4-1BB/4-1BBL共刺激信号的表达与胃癌免疫之间的关系,进一步探讨肿瘤的免疫逃逸机制,旨在为临床对胃癌的免疫治疗奠定理论和实验基础。方法:选取四种不同分化程度的人胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)作为研究对象。采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)测定人胃癌细胞株中4-1BB、4-1BBL mRNA表达;采用免疫细胞化学方法测定人胃癌细胞株中4-1BB、4-1BBL蛋白表达;采用MTT法测定不同时间段、不同效靶比时人淋巴细胞对上述四种人胃癌细胞的杀伤活性;采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay ,ELISA)测定胃癌细胞株与人淋巴细胞共同培养上清液中淋巴因子TNF-α、IL-2、IL-10的含量变化。所有实验数据用SPSS 16.0统计软件处理,P<0.05时认为差异具有显著性。结果:1胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)中4-1BB的mRNA表达:RT-PCR检测4-1BB在四种胃癌细胞株中均得到414 bp的特异性条带。用凝胶成像系统进行半定量分析显示,4-1BB的mRNA表达水平从高到低依次为: MGC-803 (77.30%)、BGC-823 (71.68%)、SGC-7901(40.06%)、MKN-28 (37.65%)。2胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)中4-1BBL的mRNA表达:RT-PCR检测4-1BBL在四种胃癌细胞株中均得到465 bp的特异性条带。用凝胶成像系统进行半定量分析显示,4-1BBL的mRNA表达水平从高到低依次为:MKN-28 (46.63%)、SGC-7901 (37.13%)、BGC-823(20.43%)、MGC-803 (14.14%)。3胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)中4-1BB的蛋白表达:免疫细胞化学法示四种胃癌细胞株( BGC-823、SGC-7901、MGC-803、MKN-28)细胞膜,胞浆均有4-1BB阳性表达。4-1BB着色程度由深到浅依次为:MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28。4人胃癌细胞株(MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803)中4-1BBL的蛋白表达:免疫细胞化学法示四种胃癌细胞株( BGC-823、SGC-7901、MGC-803、MKN-28)细胞膜,胞浆均有4-1BBL阳性表达。4-1BBL着色程度由深到浅依次为: MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。5 MTT法检测人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性:24h时,在相同效靶比情况下,人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低为:MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。E/T为20:1,10:1时,BGC-823组高于MGC-803组,但无统计学意义(P>0.05)。其他组之间比较有统计学意义(P<0.05)。且杀瘤活性随效靶比的增高而增强。48h时,在相同效靶比情况下,人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低为:MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。E/T为20:1、10:1时BGC-823组高于MGC-803组,但无统计学意义(P>0.05), E/T为10:1时MKN-28组高于SGC-7901组,但无统计学意义(P>0.05),其他组之间比较有统计学意义(P<0.05)。且杀瘤活性随效靶比的增高而增强。72h时,在相同效靶比情况下,人淋巴细胞对胃癌细胞的体外杀伤活性由高到低为:MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。E/T为40:1时BGC-823组高于MGC-803组,但无统计学意义(P>0.05),其他组之间比较有统计学意义(P<0.05)。且杀瘤活性随效靶比的增高而增强。淋巴细胞对四种胃癌细胞的杀伤活性均在72h最高,且杀瘤活性随效靶比的增高而增强,淋巴细胞在各时间段对MKN-28和SGC-7901的杀伤活性均明显高于BGC-823和MGC-803(P<0.05)。提示高表达4-1BBL的胃癌细胞有较强的体外抗肿瘤活性。6人淋巴细胞与胃癌细胞株共培养上清液中细胞因子的含量6.1 ELISA法测定上清液中细胞因子TNF-α的含量:相同效靶比时,TNF-α的含量由高到低为:MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。效靶比为40:1和10:1时, BGC-823组高于MGC-803组但无统计学意义(P>0.05),其他组之间比较有统计学意义(P<0.05)。且TNF-α的含量随效靶比的增高而增高。6.2 ELISA法测定上清液中细胞因子IL-2的含量:相同效靶比时,IL-2的含量由高到低为: MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803。效靶比为20:1时,BGC-823组高于MGC-803组但无统计学意义(P>0.05),其他组之间比较有统计学意义(P<0.05)。且IL-2的含量随效靶比的增高而增高。6.3 ELISA法测定上清液中细胞因子IL-10的含量:相同效靶比时,IL-10的含量由高到低为: MGC-803、BGC-823、SGC-7901、MKN-28。各组之间比较有统计学意义(P<0.05)。结论:1在胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803中,mRNA和蛋白水平均表达4-1BB,且表达水平基本一致。人胃粘液腺癌细胞株MGC-803和人胃低分化腺癌细胞株BGC-823上4-1BB表达水平高于人胃高分化腺癌细胞株MKN-28和人胃中分化腺癌细胞株SGC-7901,提示4-1BB表达水平越高胃癌细胞株的恶性程度越高。2在胃癌细胞株MKN-28、SGC-7901、BGC-823、MGC-803中,mRNA和蛋白水平均表达4-1BBL,且表达水平基本一致。人胃高分化腺癌细胞株MKN-28和人胃中分化腺癌细胞株SGC-7901上4-1BBL表达水平高于人胃粘液腺癌细胞株MGC-803和人胃低分化腺癌细胞株BGC-823,提示4-1BBL表达水平越高胃癌细胞株的分化程度越高。3淋巴细胞对MKN-28和SGC-7901的杀伤活性明显高于BGC-823和MGC-803组。提示淋巴细胞对胃癌细胞的杀伤力与胃癌细胞中4-1BBL的表达程度有关,淋巴细胞对高表达4-1BBL胃癌细胞的杀伤力较高。4细胞因子的分泌与胃癌细胞中4-1BBL的表达有关,胃癌细胞4-1BBL促进Th1型细胞因子TNF-α、IL-2的产生,抑制Th2型细胞因子IL-10的产生。总之胃癌细胞株的免疫状态与4-1BB/4-1BBL的表达有关,4-1BBL在胃癌细胞株中表达增高增强了对肿瘤细胞的免疫杀伤作用,当4-1BBL表达不良时,不能有效建立4-1BB/4-1BBL介导共刺激信号途径,导致机体免疫监视作用降低,发生免疫逃逸。4-1BB在胃癌细胞株中表达及作用与4-1BBL相反,至于二者之间的关系尚待进一步研究证实。