论文部分内容阅读
1.研究背景及目的靶向超声分子成像技术是指将特异性配体如抗体偶联至超声造影剂表面,经血液循环特异性地积聚于靶组织,达到靶向超声分子成像目的。具有价廉、无毒、无创、无放射污染、敏感度高、易探测、实时、可重复等优点。良好的靶向造影剂应具备：能特异性与靶位紧密结合；有足够稳定时间在靶位循环、积聚；较低剂量即可快速实现靶位与背景的高对比率；好的生物相容性等特质。目前临床采用的超声造影剂多为气态核心如SonoVueTM为微米级,平均直径在2μm-4μm,但无靶向功能,且不能透过血管壁,无法直接实现血管外病变靶向显影,因此限制了其在临床上的应用。液态PFCs核心高分子球囊(Liquid perfluorocarbons-filled nanocapsules, LNCs)具有更好的稳定性、穿透性和超声反射等特质,能更好地抵抗超声波声压和机械力作用而成为国内外研究的热点,是目前一种具有较好应用前景的超声造影剂。但目前的研究主要集中在不同材质壳膜的球囊的制备和显影特性等方面,球囊靶向修饰、影响粒径大小的因素、不同粒径纳米颗粒的理化性质、粒径大小和浓度与超声散射的关系、体内超声造影增强效果、生物分布和生物安全性等研究尚不明确。因此,本研究旨在靶向修饰并筛选出最佳粒径和浓度的LNCs特异性靶向靶标VEGFR2受体,探讨用于裸鼠HepG2种植瘤模型靶向超声显影增强的研究。2.实验方法2.1乳化-蒸发法制备DSPE-PEG修饰的LNCs,单因素实验研究均质分散速度、超声粉碎时间和功率对球囊粒径大小的影响。2.2用聚碳酸酯过滤器及梯度离心法分离纯化LNCs,将其依粒径大小分为四组,光镜、荧光显微镜及投射电镜和扫描电镜下观察球囊形态、结构；DLS法测球囊粒径和表面电位；疏水层析实验验证球囊的亲水特性；MTT法测各粒径球囊对人HUEVC细胞增值的影响。2.3体外实验观测球囊粒径大小与球囊浓度高低同超声造影增强效应的关系,并体外实验行LNCs结构和超声反射强度稳定性评估。2.4选择合适粒径和浓度的LNCs耳缘静脉注射入新西兰兔,观察球囊体内造影增强效应。2.5制备合适粒径的biotin-LNCs,通过biotin-avidin system制VEGFR2受体靶向的纳米球囊(V2-LNCs).荧光免疫试验验证biotin-LNCs与配体biotin-labeled anti-VEGFR2抗体的结合。2.6光镜、荧光显微镜及投射电镜和扫描电镜下观察靶向修饰对球囊形态、结构的影响；DLS法测V2-LNCs粒径和表面电位；疏水层析实验验证V2-LNCs的亲水特性；MTT法测V2-LNCs对人HUEVC细胞增值的影响；体外超声显影实验观察靶向修饰对球囊超声造影增强特性的影响。2.7体外细胞结合试验：设PBSs V2-LNCs、 LNCs、 IgG-LNCs四组分别与人HUEVC细胞和人HepG2细胞孵育2h；用anti-VEGFR2抗体预处理细胞后再与V2-LNCs孵育做阻断试验；将V2-LNCs分别与细胞孵育0.5h和1.5h的时间,观察V2-LNCs结合效率与孵育时间的关系。2.8体内实验观察V2-LNCs与LNCs对裸鼠人HepG2细胞种植瘤模型的超声显影增强效应(分别经尾经脉和瘤内注射)。免疫荧光观察其在尾经脉注射组瘤内的分布差异。2.9V2-LNCs与LNCs分别经尾经脉注射ICR小鼠,免疫荧光分析分别观察V2-LNCs与LNCs在小鼠主要脏器的分布,并收集小鼠全血,测其血清中ALT／AST等指标评估其生物安全性。3.实验结果3.1制备了不同粒径的DSPE-PEG修饰的LNCs,其平均粒径随均值速度、超声粉碎时间和功率的增加而降低。3.2不同粒径下LNCs大小均匀、呈球形、具有壳核结构；有较好的亲水特性；各粒径球囊对人HUEVC细胞增值无太大影响。3.3体外超声显影增强实验：粒径为220nm-450nm的LNCs球囊在O.05mg／mL.0.5mg／mL.5mg／mL.50mg／mL时都具有较好的超声反射特性,适宜用于体内显影增强。在低浓度(0.005mg／mL)时LNCs粒径大小与超声造影增强效应呈正相关。高浓度(50mg／mL)时出现声衰减,且衰减程度随粒径增加而增加。浓度为0.05mg／mL.0.5mg／mL.5mg／mL时,粒度≤100nm的LNCs超声反射强度较弱。稳定性观察示LNCs大小和超声反射具有良好的稳定性。3.4粒径为220nm一450nm的LNCs以浓度5mg／mL,100μL／Kg耳缘静脉注射入新西兰兔体内后,可明显增强其血管和肝肾超声反射效果。3.5制备了粒径为220nm一450nm的biotin—LNCs,并通过biotin-avidin system制备了V2-LNCs.荧光免疫试验阳性,证明配体biotin.labeled anti-VEGFR2antibody与biotin.LNCs结合。3.6靶向修饰后球囊形态、结构无改变；粒径和表面电位无明显变化；仍具亲水特性；对人HUEVC细胞的增值无影响；对体外超声显影增强特性无影响。3.7体外细胞结合试验：V2-LNCs能较好的黏附在人HUEVC细胞和人HepG2细胞上,反复洗涤不掉,用anti-VEGFR2抗体预封闭细胞可成功阻断其与细胞的靶向结合,而作为对照的LNCs、 IgG-LNCs经反复洗涤后纳米球囊与细胞完全分离,无结合,空白PBS组细胞无红色荧光。V2-LNCs与人HUEVC细胞和人HepG2细胞具有较强的靶向结合能力,且结合效率与孵育时间相关。3.8体内超声显影实验：V2-LNCs和LNCs瘤内注射组肿瘤超声显影效果均增强；而尾经脉注射组在注射当时和0.5h,1h,2h,4h,12h,24h二者均未见明显的超声散射效果增强。荧光免疫实验显示V2-LNCs在瘤内血管内皮和肿瘤实质蓄积较LNCs组明显增多。证明V2-LNCs能粘附并透过肿瘤血管壁,通过靶向结合作用积聚于肿瘤实质和血管内皮。显示LNCs积聚并不是超声显影增强的唯一决定因素。3.9生物分布和生物安全性：球囊在ICR小鼠主要脏器均有分布,其ALT, AST, TBA, LDH等指标无异常,主要脏器镜下未见损伤,表明V2-LNCs和LNCs均具有良好的生物安全性。4.结论4.1LNCs粒径随均值速度、超声粉碎时间和功率增加而减小。4.2LNCs体外超声显影增强效果受粒径大小和浓度高低的影响,筛选出粒径为220nm-450nm,浓度5mg/mL的LNCs,体内实验显示良好的超声显影增强效果。4.3成功制备了携带anti-VEGFR2antibody的靶向LNCs,理化性质稳定且具有良好的体外靶向结合能力和肿瘤部位蓄积能力,一定的超声显影增强效果和良好的生物安全性。