百菌清单克隆抗体的制备及ELISA快速检测方法的建立

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百菌清(CTN)是一种非内吸性广谱有机氯杀菌剂,它在土壤中经光、酶或微生物等作用后转化为羟基百菌清,其毒性和稳定性增加,不仅危害到了人的身体健康,还对环境造成了污染。相关的研究可以看到百菌清是一种能使动植物细胞发生遗传性突变的化学物质。因此,研究建立快速、灵敏、有效的百菌清残留检测方法可以解决很多现实问题。百菌清残留免疫学检测比其他的检测方法更加的灵敏和准确,本研究在分析CTN免疫学特性的基础上,运用单抗技术制备了百菌清的单克隆抗体,同时也获得了CTN的ELISA试剂盒。主要研究结果如下:1.CTN人工抗原的制备和鉴定结果:乙二醇法合成衍生物羟基百菌清(CTN-OH);羰基二咪唑法合成全抗原CTN-BSA、CTN-OVA,紫外分光光度法(UV)、凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定;用CTN-BSA免疫BALB/c小鼠,之后通过间接ELISA和间接竞争ELISA来测定制备的百菌清多抗的血清的效价和其敏感性,以此来确定制备的抗体的特性。UV扫描图谱结果和SDS-PAGE电泳的结论可以得知CTN-OH与BSA偶联成功。2号小鼠抗血清的效价最高,对CTN的半数抑制浓度(IC50)为93.593ng/mL,并且与其他竞争物基本没有交叉反应。从CTN抗原的制备实验中可以看到本实验制得的百菌清多抗具有一定的应用价值。2.CTN单抗的制备和其免疫学特性鉴定:使用ELISA方法检测来获得效价高的小白鼠作为实验所用的细胞融合备用鼠,然后通过杂交瘤技术制备百菌清单克隆抗体(CTNmAb),并对其效价、亲和力、敏感性、特异性、亚型进行鉴定;筛选出了4A31E8、4A31F4、4A32A10、4A32E2四株敏感特异的杂交瘤细胞;测得的结果看出细胞培养上清的效价为1:6×1021:6×103,4A31E8诱生小鼠制作的效价为1:5.12×105,单抗亚型鉴定为IgG1;CTN单克隆抗体的亲和常数Ka为3.1×1010L/moL,对CTN的IC50为21.6685ng/mL;与五氯硝基苯的交叉反应率为1.98%,与其它竞争物无交叉反应。最后获得的结果看出制备的CTNmAb的效价和特异性都很好。3.百菌清ELISA试剂盒的制备:使用ELISA的方法最后得到最优的包被抗原浓度为2μg/mL,抗体工作浓度为1:64000,确立了间接竞争ELISA的快速检测的措施,同时组装了百菌清间接竞争的ELISA快速检测试剂盒;通过对制备的试剂盒进行活性和性能检测,得到的数据显示研制的百菌清试剂盒可以用于实际样品的检测,并且获得的标准曲线线性回归方程的相关系数很高,达到了0.9932,半数抑制浓度IC50为29.44ng/mL。通过上述实验可以看出制备的CTN-Kit灵敏度高,具有很好的特异性,而且性质稳定,可以保存半年以上不失效。
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