第一部分纳米金棒、荧光金微泡及载基因荧光金微泡的制备、表征及生物相容性研究[目的]研究纳米金棒(gold-nanorods, AuNRs)、荧光金微泡(AuNRs loaded fluorescent microbubbles, fluorescent AuMBs)和载基因荧光金微泡(gene-loaded fluorescent AuMBs)的制备、表征、生物相容性及光热动力学特性,为后续的肝癌的双模态成像和综合治疗研究奠定基础。[方法]①以酚类物质为还原剂的改良的无种子法制备AuNRs,运用透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM)、马尔文激光粒度仪(Malvin laser particle size analyzer)、紫外可见近红外分光光度计对其大小、形态、分散性、水合粒径、zeta电位及紫外吸收光谱进行表征；②采用薄膜水化-机械震荡法制备NIR797标记的荧光金微泡；运用TEM和光学显微镜观察荧光金微泡的形态、分散度及均一性；利用马尔文激光粒度仪检测其平均水合粒径及表面电位；运用紫外可见近红外分光光度计检测近红外荧光染料偶联状况；之后通过静电吸附作用进一步结合质粒DNA制备载基因荧光金微泡；③采用MTT (methyl thiazolyl tetrazolium)试验和体外溶血试验检测载基因荧光金微泡的体外生物相容性和血液相容性；④在近红外(near-infrared, NIR)激光器的作用下观察不同浓度的AuNRs和载基因荧光金微泡的体外光热升温情况。[结果]①制备的AuNRs在TEM下显示为长棒状、大小较一致、分散性好；其平均水合粒径长径约为110nm,短径约为22nm,长径比约为5；平均zeta电位值为+25.6 mV；紫外吸收光谱显示AuNRs的横向吸收峰在520nm附近,纵向吸收峰在880nm附近；②自制的荧光金微泡TEM下呈圆球形外观,外包被一薄层脂质膜,内充有透亮的SF6气体,磷脂薄膜内外侧及膜上可见纳米金棒附着。平均水合粒径约为1.8um,平均zeta电位值为-17.7mV。紫外近红外吸收光谱显示NIR797被偶联上。生物相容性和血液相容性试验显示载基因荧光金微泡的毒性评价为0-1级,无毒性；无溶血发生；③在功率为2.5 W,波长为808 nm的NIR激光照射下,不同浓度的纳米金棒能升温到38℃-53℃不等,且加热30 min后温度能恒定在某一水平不发生改变；而在同等条件的NIR激光照射下,载基因荧光金微泡溶液能升温到39.5℃-51℃不等,且加热30min后温度能恒定在某一水平不发生改变。[结论]①应用以酚类物质为还原剂的改良的无种子法成功制备了AuNRs;②应用薄膜水化-机械震荡法成功制备了NIR797标记的荧光金微泡并在此基础上进一步制备了具有良好生物相容性的载基因荧光金微泡；③自制的AuNRs和载基因荧光金微泡具有良好的光热吸收特性,具备吸收光能而升温并达到恒温(44℃)的能力,可用于肿瘤的近红外光热疗。第二部分pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK质粒构建及鉴定[目的]①构建用于肝癌基因治疗的、以COX2p为启动子,融合自杀基因(yCDglyTK)为治疗基因的重组真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK;②检测超声靶向微泡击破(ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD)技术增强载基因金微泡的基因转染能力,评价两者联合作为基因转运载体的可行性。[方法]①合成人COX2启动子,用MluI+EcoRI酶切pUC19-Kan-COX2p,获得COX2p片段,然后将其构建至pCDNA3.1-EGFP载体上,取代原有的CMVp片段,构建pCDNA3.1-COX2p-EGFP;②将yCDglyTK构建至pDoubleEx-EGFP,获得pDoubleEx-EGFP-yCDglyTK。用COX2启动子替换pDoubleEx-EGFP-yCDglyTK上的CMV启动子,获得pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK。所有构建的重组真核质粒都经过测序和酶切鉴定；③载基因金微泡联合UTMD技术体外转染人肝癌Bel-7402细胞(裸质粒、Lipofectamine 2000和裸质粒联合UTMD作为对照),并用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染情况和检测转染效率。[结果]①酶切、测序鉴定结果表明每步均得到了目的质粒,经PCR扩增获得的目的基因分子量与预计的相同,插入载体位置正确,测序发现插入片段序列无改变,且开放读码框正确。②载基因金微泡联合UTMD技术体外转染Bel-7402细胞,可将外源基因传递到细胞内,转染6h后细胞内即可出现绿色荧光,48h达最强,其转染效率可达79.73%。[结论]①pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK抗肿瘤基因质粒被成功构建并被鉴定,为后续肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。②载基因金微泡联合UTMD技术可将外源性基因成功转染至Bel-7402细胞系并高效表达,为基因治疗实验中pDoubleEx-EGFP-COX2p-yCDglyTK质粒的细胞转染提供了有效的基因载体。第三部分载基因荧光金微泡的US/NIRF双模态成像研究[目的]①从体外水平观察载基因荧光金微泡的超声造影成像及UTMD试验；②在体水平观察载基因荧光金微泡在正常兔肾和人肝癌裸鼠移植瘤的超声造影成像；③从体外水平观察载基因荧光金微泡的近红外荧光(near-infrared fluorescence, NIRF)成像；④在体水平观察载基因荧光金微泡联合UTMD在人肝癌裸鼠移植瘤的NIRF成像。[方法]①体外超声造影成像：采用自制的体外超声成像模型进行。直径2mm的塑胶管被固定在盛有1升脱气水的水槽中；超声探头紧贴管子表面垂直放置；充满管腔内的脱气水二维超声图像首先被采集,随后不同浓度的载基因荧光金微泡和临床经济可得的声诺维(SonoVue(?))造影剂随机从管子的一端注入,注入的同时启动造影模式(Contrast-Tuned Imaging, CnTITM)对流动的微气泡进行超声造影成像。待造影图像达最强时,采用治疗性超声辐照管腔,随后对辐照后的管腔进行超声造影观察；②体内超声造影成像：首先经兔耳缘静脉注射载基因荧光金微泡对正常兔肾进行超声造影成像,SonoVue造影剂用作对比。随后经荷瘤成功的裸鼠尾静脉注射载基因荧光金微泡对肝癌移植瘤进行超声造影成像。体内、外超声造影成像均采用临床用MyLab Twice超声诊断仪,LA332探头(百胜公司,意大利),所有图像均被采集和存贮,并采用Image J软件对图像感兴趣区(ROI)的平均灰度值进行定量分析,并描绘时间-强度曲线。SPSS 18.0统计软件用于统计分析；③体外NIRF成像：不同浓度的载基因荧光金微泡置于Eppendorf管后进行NIRF扫描,SonoVue(?)造影剂和生理盐水用作对比：④体内NIRF成像：裸鼠移植瘤被随机分为UTMD组和非JTMD组,前者于造影剂注入的同时外加超声辐照肿瘤区,两组均于造影剂注入后0h、1h、2h、4h、6h、24h和48h进行NIRF扫描。另于实验结束后颈椎脱臼处死裸鼠,摘取裸鼠心、脑、肝、脾、肺、肾、小肠及肿瘤组织进行活体脏器离体NIRF扫描。体内外NIRF成像均采用近红外活体多光谱成像分析系统(美国CRi公司, Maestro系统),NIR序列激发(670 nm-900 nm或740 nm-950nm,间隔10 nm)。特异性信号应用MaestroTM EX 2.10软件进行光谱分离。[结果]①体外超声造影显示,相比脱气水的无回声,载基因荧光金微泡和SonoVue(?)注入后管腔均显示为强回声,两者回声强度相似,且均呈现为浓度依赖性的回声增加。体外UTMD试验显示,超声辐照后管腔强回声瞬时变成了无回声；②正常兔肾超声造影显示,载基因荧光金微泡能够对兔肾进行有效的超声造影增强显像,造影效果和SonoVue(?)相似；裸鼠移植瘤超声造影显示,载基因荧光金微泡注入1s左右时肿瘤声像图即开始出现增强,12s左右达最强,大约1 min后开始慢慢减退；③体外NIRF成像显示,不同浓度的载基因荧光金微泡组均可探测到明亮的荧光信号,且随着造影剂浓度的增加,其荧光信号强度逐渐增强。而SonoVue(?)和生理盐水组则探测不到任何荧光信号；④体内NIRF成像显示,联合UTMD组在整个观察时间段内肿瘤区均能探测到荧光信号,而未联合UTMD组肿瘤区仅于造影剂注入后一段时间内观察到荧光信号,1h以后的观察时间段内均未探测到荧光信号。活体脏器离体NIRF成像显示辐照组肿瘤区可探及荧光信号,而非辐照组肿瘤区探测不到。[结论]①载基因荧光金微泡同时具有超声对比增强和近红外荧光成像的能力,可作为US/NIRF双模态影像对比剂用于肿瘤诊断成像；②UTMD技术被证实能有效击破微泡并将所载物质传递到靶区,因此为后续的超声辐照下的裸鼠移植瘤的靶向治疗实验提供了可行性的依据。第四部分载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因治疗肝癌的体内外实验及其机制研究[目的]研究载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因对肝癌的体内外治疗作用,并从分子水平上探讨其治疗机制。[方法]①将Bel-7402细胞接种在6孔板中,随机分成以下5组：(1)阴性对照组；(2)载基因荧光金微泡组(基因治疗组)；(3)载基因荧光金微泡+NIR辐照组(光热-基因治疗组)；(4)载基因荧光金微泡+US辐照组(US-基因治疗组)；(5)载基因荧光金微泡+US/NIR双辐照组(双辐照-光热-基因治疗组)。5组细胞分别处理后48 h,利用CCK-8法和流式细胞术(FCM)评估体外治疗实验治疗效果；②荷瘤裸鼠随机分成5组(5只／组),分组同上。尾静脉注射载基因荧光金微泡后按体外实验要求对每组动物实施治疗。治疗后每5天称重一次裸鼠并观察肿瘤的生长情况,每周重复一次治疗,共4次。30天后处死裸鼠,通过肿瘤体积抑制率、裸鼠体重、瘤组织及内脏器官组织切片HE染色评估抑瘤效果；采用免疫组织化学方法、Western blot和实时荧光定量PCR检测瘤组织中与凋亡相关的指标(如Survivin、Bax、Bcl-2和P53)。[结果]①CCK-8结果显示对照组,基因治疗组、光热-基因治疗组、US-基因治疗组和双辐照-光热-基因治疗组的平均细胞增殖率分别是100%、73.19%、45.97%、31.24%和18.56%。相对应的平均凋亡率分别为4.19%、14.2%、26.04%、38.94%和50.6%。细胞电镜检测发现,各治疗组细胞均出现了不同的凋亡形态学变化,但双辐照-光热-基因三联靶向治疗组细胞呈现了较为明显的凋亡形态学变化；②体内抑瘤实验结果显示双辐照-光热-基因治疗组的平均肿瘤体积抑制率高达97.03%,较其它各组有统计学差异(P<0.05),而裸鼠体重较其它组没有明显减轻。HE染色病理组织学检测显示所有肿瘤组织均出现不同程度的坏死,其中US/NIR双辐照-光热-基因治疗组坏死程度最严重；而各组裸鼠内脏器官未出现病理改变。免疫组化结果显示,与对照组相比,各治疗组的Bcl-2、P53和Survivin表达均有所减弱,而Bax表达有所增强。实时定量PCR和Western blot检测结果示双辐照-光热-基因三联靶向治疗组能够明显下调Bcl-2, P53和Surviv in的mRNA及蛋白的表达,上调Bax的mRNA及蛋白的表达。[结论]载基因荧光金微泡联合US/NIR双辐照-光热-基因治疗肝癌,能够发挥协同增效作用,有效抑制肝癌细胞的增殖和肿瘤组织的生长。