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目的:
KIF4是KIFs家族中一员,是一类以氨基末端为驱动结构域的驱动蛋白。阿霉素是治疗乳腺癌常用的有效化疗药物之一。低剂量的阿霉素常常诱导肿瘤细胞衰老,这有助于降低药物的多药耐药(MDR)现象。探讨KIF4A在阿霉素处理的人乳腺癌细胞MCF-7表达的变化,有助于进一步阐明KIF4A的功能及其与阿霉素诱导的肿瘤衰老的关系。
方法:
接种MCF-7细胞于培养皿,次日用1μmol·L-1的阿霉素处理细胞2小时,对照不处理,后换以10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2继续培养细胞。分别于阿霉素处理后第12、24、48、72、96小时,用RIPA裂解缓冲液裂解细胞收集蛋白,用Bradford方法测定蛋白浓度,取等量(25μg)蛋白进行Westernblot检测。用抗KIF4A抗体检测KIF4A,用β-微管蛋白作为上样对照(loadingcotrol)。将Western blowing的结果用Image-Pro Plus6.0软件进行光密度分析,之后将各蛋白条带的光密度值用于下列公式计算KIF4A蛋白表达抑制率:KIF4A蛋白表达抑制率(%)=100%x[(未处理组KIF4A蛋白/β-微管蛋白)-(处理组KIF4A蛋白/β-微管蛋白)]/(未处理组KIF4A蛋白/β-微管蛋白)。
接种MCF-7细胞于培养皿,次日分别用0、0.05、0.1、0.5、1、2μmol·L-1的阿霉素处理细胞2小时,后换以10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2继续培养细胞。于阿霉素处理后第96小时取出培养皿,收集蛋白,行蛋白浓度测定,取等量蛋白行Western blot检测。用Image-Pro Plus6.0软件进行光密度分析,并且计算KIF4A蛋白表达抑制率。
用PCR扩增KIF4A基因完整开放读码框架(ORF),并将其与pEGFP-C1连接,形成KIF4A的真核表达质粒pEGFP-KIF4A。在35mm培养皿内,将pEGFP-KIF4A和作为对照的pEGFP-C1质粒用LipofectaminTM转染入MCF-7细胞中。20-24小时后,用阿霉素处理,而后置于荧光显微镜下观察KIF4A的表达及分布。
接种适量的MCF-7细胞于培养皿,次日用1μmol·L-1的阿霉素处理细胞2小时,对照不处理,后换以10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2继续培养细胞。于阿霉素处理后第96小时,取出培养皿,行衰老相关半乳糖苷酶染色,次日于倒置显微镜下观察衰老细胞,计算衰老染色率(染色阳性细胞数/计数的总细胞数)。
结果:
阿霉素处理后不同时间段收集蛋白行Western blot检测结果分析发现,在处理后第12、24和48h,阿霉素虽可抑制KIF4A蛋白表达,但其抑制作用并不十分明显,KIF4A蛋白与β-微管蛋白光密度比值分析显示,其表达的抑制率仅介于20%~35%之间;而在72和96h,阿霉素处理的MCF-7细胞表达KIF4A显著降低,其表达的抑制率均高达65%以上,其中,尤以96h最明显。
用不同浓度的阿霉素处理MCF-7细胞,96h后收集蛋白行 Western blot检测结果分析发现,虽然0.1μmol·L-1以下浓度的阿霉素对KIF4A蛋白表达无明显影响,但0.5μmol·L-1及以上浓度的阿霉素均可显著降低KIF4A蛋白水平,KIF4A蛋白与β-微管蛋白光密度比值分析显示其表达的抑制率均高达50%以上,并且呈浓度依赖性。
pEGFP-KIF4A质粒构建成功,将其转染入MCF-7细胞高表达KIF4A,镜下观察带有绿色荧光的KIF4A蛋白主要分布在细胞核,呈圆形或椭圆形,核仁未见分布。用阿霉素处理之后,其分布未见改变。
与未用阿霉素处理的MCF-7细胞相比,用1μmol·L-1的阿霉素处理2小时的MCF-7细胞的衰老相关半乳糖苷酶染色率由5%提高到42%,细胞核周边出现蓝染区域,细胞呈衰老样变:体积变大,扁平,胞浆颗粒增多,富含液泡。
结论:
阿霉素处理MCF-7细胞可使KIF4A蛋白表达水平降低,且有浓度依赖性。阿霉素对高表达的KIF4A在MCF-7细胞中的分布没有影响。阿霉素处理的MCF-7细胞衰老阳性率提高。KIF4A蛋白表达降低与阿霉素引起MCF-7细胞衰老的关系有待进一步研究。