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背景:支气管哮喘（以下简称哮喘）是一种常见慢性疾病,严重影响人类健康,其中嗜酸性粒细胞作为哮喘发生发展的重要细胞组分,也是糖皮质激素和多种生物制剂的主要靶点,但目前临床应用的糖皮质激素和生物制剂存在不良反应多、治疗成本高等问题。因此,寻找可替代或协同糖皮质激素或生物制剂的高性价比药物迫在眉睫。青蒿琥酯是青蒿的主要有效成分之一,本课题组前期研究发现,青蒿琥酯腹腔注射可逆转哮喘模型小鼠中升高的嗜酸性粒细胞数量（包括支气管肺组织及支气管肺泡灌洗液）,可能机制涉及细胞程序性死亡。方法:本研究分为四个部分。第一部分通过网络药理学和分子对接技术,对青蒿琥酯及其体内活性产物（双氢青蒿素）的基本药学性质进行评价,通过公共平台获取青蒿琥酯及双氢青蒿素的潜在作用靶点和潜在哮喘治疗靶点,构建化合物-靶点网络、蛋白质互作网络、筛选枢纽基因,进而进行富集分析和分子对接,预测青蒿琥酯治疗支气管哮喘的可能机制和作用靶点。第二部分通过构建支气管哮喘小鼠模型、分组进行药物干预后,评估小鼠行为学变化、通过肺功能仪测定小鼠气道高反应性、苏木紫-伊红病理染色观察评估小鼠气道炎症浸润严重程度、流式细胞计数评估支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量及活性,评估青蒿琥酯在体内对哮喘嗜酸性粒细胞的影响。第三部分通过构建白介素-5活化的嗜酸性粒细胞模型、分组进行药物干预后,通过细胞增殖/毒性检测观察不同时间点、不同浓度青蒿琥酯对体外嗜酸性粒细胞的影响;之后通过构建拟合方程,选出合适的给药浓度及给药时间;通过予不同程序性死亡通路抑制剂,测定各组细胞活性,判断青蒿琥酯诱导嗜酸性粒细胞死亡的具体形式。第四部分通过小鼠肺组织免疫组化染色和体外嗜酸性粒细胞免疫印迹,评价青蒿琥酯对受体相互作用丝氨酸苏氨酸激酶1介导通路上各靶点蛋白表达水平的影响。结果:1.网络药理学及分子对接结果显示,青蒿琥酯成药性、安全性良好,可能影响哮喘发生发展的以下机制:调节类固醇激素的生物合成和代谢以及机体对类固醇激素的反应、调节机体对内外刺激的反应、影响体内免疫与炎症反应、影响腺体发育和细胞外基质组成、调控细胞趋化与生存/死亡等;作用靶点可能为PTGS2、MAPK3、JAK2、MTOR、CASP8、ERBB2、MAP2K1、CCND1 和 EGFR。2.小鼠体内实验显示,与哮喘模型组小鼠相比,青蒿琥酯可显著降低小鼠支气管（P＜0.001）、肺血管旁（P＜0.0001）及肺实质中（P＜0.01）炎症细胞浸润,降低支气管肺泡灌洗液内嗜酸性粒细胞数量（P＜0.001）,增加支气管肺泡灌洗液内嗜酸性粒细胞死亡比例（P＜0.01）。3.体外细胞实验显示,100μM及以上浓度青蒿琥酯在各时间点均可明显抑制IL-5活化的嗜酸性粒细胞的活性（P＜0.0001）,干预24小时及以上各浓度青蒿琥酯均能抑制嗜酸性粒细胞的活性（P≤0.0001）。半抑制浓度分别为6h:166.00μM、12h:210.74μM、24h:226.08μM、48h:43.51μM。透射电镜显示,与空白对照组相比,随着干预时间延长,嗜酸性粒细胞体积逐渐增大,细胞器肿胀明显,尤其是线粒体嵴逐渐肿胀、消失、空泡化,细胞质膜和核膜均有不同程度的受损,胞内容物外溢。予不同细胞死亡通路抑制剂干预后,0.5μM和1μM坏死性凋亡抑制剂Necrosulfonamide（NSA）可明显逆转青蒿琥酯诱导的嗜酸性粒细胞死亡（P值分别为0.0376和0.0013）,各浓度凋亡焦亡抑制剂Q-VD-OPh对嗜酸性粒细胞活性无影响（P 值分别为 25nM:P=0.3814、50nM:P=0.3145、100nM:P=0.2448）,联合使用NSA和Q-VD-OPh对青蒿琥酯干预嗜酸性粒细胞活性的影响与单用 NSA 无差异（NSA 1μM:P=0.9975、2μM:P=0.9120）,40nM（P=0.0002）和80nM（P＜0.0001）铁死亡抑制剂Liproxstatin-1可显著逆转青蒿琥酯诱导的嗜酸性粒细胞死亡,各浓度自噬抑制剂3-Methyladenine显著增强青蒿琥酯对嗜酸性粒细胞活性的抑制作用（均为P＜0.0001）。4.体内免疫组化染色结果示,哮喘模型组小鼠比正常对照组小鼠肺内RIPK1水平明显升高（P＜0.0001）;加用青蒿琥酯后,RIPK1表达水平明显降低（P=0.0073）,caspase-8 表达轻度升高（P=0.0101）,p-MLKL 表达水平升高（P=0.0278）,RIPK3表达无统计学差异（P=0.0924）。体外嗜酸性粒细胞免疫印迹结果示,与无干预的活化嗜酸性粒细胞相比,添加青蒿琥酯作用24小时后,嗜酸性粒细胞中RIPK1和caspase-8表达明显降低（P＜0.0001）,p-RIPK1和p-RIPK1/RIPK1 比值明显升高（P＜0.0001）,RIPK3（P=0.0014）和 p-MLKL（P=0.0062）表达明显升高。结论:1.计算机模拟分析示青蒿琥酯可通过多靶点、多通路、多机制发挥治疗哮喘的作用,同时其临床应用安全性良好,有望成为安全、有效、性价比优的抗哮喘治疗药物。2.体内实验示青蒿琥酯可显著降低哮喘小鼠气管旁、血管旁及肺实质中炎症浸润,并通过诱导肺内嗜酸性粒细胞发生程序性死亡降低嗜酸性粒细胞数量。3.体外实验示青蒿琥酯可明显降低体外活化嗜酸性粒细胞活性,诱导其发生程序性死亡,具体形式为坏死性凋亡和铁死亡。4.体内外实验示青蒿琥酯可调控RIPK1和caspase-8表达,诱导嗜酸性粒细胞通过RIPK1/RIPK3/MLKL介导的信号通路发生坏死性凋亡。