研究背景终末期肾脏病(end-stage renal disease, ESRD)的流行病学研究(美国肾脏病数据库系统及欧洲等资料)显示全球ESRD人数仍在持续增加,每年新增的人数超过了人口的年增长率。维持性血液透析是ESRD的一种常规治疗,也是目前应用最多的肾脏替代治疗,至今已有50余年的历史。由于肾脏功能的衰竭,大量的毒素蓄积在体内难以清除。在中国,鉴于目前的国情,绝大部分ESRD患者选择了血液透析治疗。血液透析将血液引出体外后,借助透析膜分隔血液和透析液,主要通过扩散、对流、超滤三种方式达到部分替代正常肾脏排泄水分、代谢废物、调节水电解质平衡、纠正酸中毒等功能。一般血液透析治疗仅能替代正常肾脏功能的十分之一左右。血液透析是一种体外的血液净化手段,维持性血液透析患者(maintenance hemodialysis patients, MHD)经常接触到体外循环系统如穿刺针、透析器、透析管路等。另外,一般每周2-4次往返医院进行血液透析、源源不断的经济支出以及接踵而至的各种并发症等,种种因素导致绝大部分MHD面临病痛、经济、精神等多重负担。随着透析时间的延长,往往频发营养不良、免疫紊乱、心血管疾病、不宁腿综合征(restless legs syndrome、抑郁、焦虑、睡眠障碍、钙磷代谢紊乱、贫血等。营养不良和免疫失调是MHD的显著特征。目前已有大量的数据表明营养不良是透析病人死亡的最大原因之一。营养不良可导致血液透析患者的免疫功能和体力活动功能下降,与各种感染和非感染的并发症相关,是尿毒症死亡率升高的独立危险因素。另外,尿毒症患者固有免疫和适应性免疫功能双重受损,这种免疫系统的改变与高发的心血管疾病和死亡率与有关。炎症-免疫紊乱也是导致尿毒症患者发生心血管疾病的重要机制之一,免疫活化可导致微炎症状态,引起冠状动脉粥样硬化和心血管事件的发生。目前认为免疫紊乱也是导致MHD其他多种并发症的重要原因。因此研究并干预MHD的营养状态和免疫功能对降低感染和心血管事件发生率,改善MHD的预后有重要的科研和临床意义。免疫功能障碍是导致血液透析患者感染和肿瘤高发的主要原因。色氨酸(Tryptophan,Trp)是人体的一种必需氨基酸,参与蛋白质的合成及多种组织代谢,犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)是Trp的代谢终产物,吲哚胺2,3-双加氧酶(indloeamine-2,3-dioxygenase,IDO)是Trp代谢为Kyn的关键酶,IDO可通过抑制T细胞的增值来诱导免疫耐受。免疫耐受是尿毒症患者免疫紊乱的重要机制,树突状细胞群可通过诱导调节性T细胞介导免疫耐受。目前认为,表达IDO的树突状细胞是发挥免疫耐受作用的关键分子,使用IDO抑制剂能快速诱导T细胞介导的排斥反应,因此IDO被认为是调控免疫平衡的重要机制。既往研究也发现Trp及其代谢产物Kyn参与免疫调控,尿毒症患者Trp/Kyn的水平与低免疫反应及心血管疾病相关,但目前MHD的IDO的水平及引起免疫紊乱的机制尚未完全清楚。定量分析MHD血浆中Trp和Kyn可为了解MHD的营养状态及免疫功能提供理论依据,具有一定的科研和临床意义。高压液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是目前常见的用以检测血浆中Trp和Kyn的方法,当检测样品流经色谱柱时,检测样品中各组分因吸附力大小不同而分离,当通过检测器时,可得到相应的信号-时间曲线,从而定量各种组分。既往有研究者使用HPLC检测了慢性肾功能不全患者血浆中的Trp和Kyn,但我们在借鉴该方法检测MHD血浆中这两种氨基酸时,可能因MHD血浆中尿毒症毒素多,彼此干扰大、难以分离。为了简化操作流程,在同一色谱条件下同时检测到MHD血浆中的Trp和Kyn,本研究对此进行了探讨。研究目的1、评估2012年12月在广东省人民医院血液净化中心行维持性血液透析的患者的营养状态,了解营养不良的发生率,分析营养不良的相关影响因素；2、改良HPLC同时定量分析MHD血浆中的Kyn和Trp,为评估透析患者的营养状态、免疫功能,了解IDO的活性提供一定的理论依据。研究方法本研究主要采用横断面分析的研究方法,通过问卷调查、临床身体指标测量、各种实验室指标、透析数据的收集等方法搜集资料以了解MHD营养不良的现状,基本入组标准为：1)同意参与本项调查并签署知情同意书,2)维持性血液透析时间≥3个月,3)能清楚自主表达自己的意愿；采用HPLC方法检测MHD血浆中的Trp和Kyn。关于MHD营养状态的评估,本研究不仅关注了传统的血浆白蛋白及营养不良相关的主观评估,同时联合了目前国际上常用的营养不良-炎症评分(Malnutrition-Inflammation Score,MIS)及透析营养的客观评分表(Objective Score of Nutrition on Dialysis,OSND)。其中MIS评估内容涉及到MHD过去3到6个月干体重的变化、饮食摄入、胃肠道症状、营养相关的功能障碍、透析合并症、透析时间、脂肪储备实测值、肌肉消耗、身高体重指数(Body Mass Index,BMI)、血浆白蛋白、总铁结合力、转铁蛋白；OSND的评估包括过去3到6个月干体重的变化、BMI、三头肌皮褶厚度、上臂中围周径、转铁蛋白、血清白蛋白、胆固醇等。这两个量表的各项指标根据不同的等级划分不同的分数,汇总后得到最终的评估结果,其中MIS的评分标准为：<8分,轻度营养不良；9-18分,中度营养不良；>18分,重度营养不良,MIS正常值为0分,最高30分。OSND的评分标准为：28-32分为正常,23-27分中度营养不良,≤22分重度营养不良,OSND正常值为5分,最高32分。调查表由研究者在MHD透析期间进行临床问询并记录结果,其中皮褶厚度、肌肉储备、中臂围周径等临床测量也在透析期间进行。所有测量使用同一个皮褶厚度测量仪和同一个标尺,每次测量前校正,每个指标测量3次,取平均值,对测量数据进行记录。同期收集入组患者的基本资料、实验室、透析数据及问卷调查内容,如年龄、基础病、维持性血液透析的时间、残余尿量、血红蛋白、血清铁、甲状旁腺素、透析器的通透性、血流量、透析模式等。各评估量表身体指数的测量、诊断及严重程度评估、实验室资料的录入由同一名研究者负责,汇总相关数据后进行统计分析。既往研究者使用HPLC检测了慢性肾功能不全患者血浆中的Trp和Kyn,本研究在借鉴该方法用于检测MHD血浆中的Trp和Kyn时,发现在色谱图上,Trp和Kyn峰与周围色谱峰融合,谱带拖尾,无法分离,难以定量分析。本研究通过调整HPLC的2个关键因素,色谱柱和流动相,拟摸索到一个比较合适的检测窗。采用的色谱柱为Sinochrom ODS-BP C18柱(4.6mm x150mm,id,4.5μm),流动相15mmol/L乙酸钠-乙酸(含5%乙腈,PH4.8),流动相流速1.0mL/min,紫外检测波长225mm。取MHD上机前全血3-4ml,置于4mlEDTA管内,采血后1小时内于常温下以2500r/min的速率,离心5分钟分离血浆,血浆经5%高氯酸溶液去除蛋白质后沉淀,取上清液20μ l直接进样分析测定。统计学分析对符合正态分布的数据用x±S表示,不符合正态分布的数据用中位数表示,采用logistic回归分析方法进行相关因素分析,P<0.05认为差异有统计学意义,应用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。研究结果1、2012年12月广东省人民医院血液净化中心MHD营养状况及相关影响因素：1)共217名MHD符合入选要求纳入本项调查,MIS评分为9±2分,其中轻度营养不良81人,中度营养不良135人,重度营养不良1人；2) OSND评分为12±3分,均为重度营养不良；3)84.4%患者血浆白蛋白未达标,30.4%患者BMI低于正常值,三头肌皮褶厚度14.5±7.0mm,中臂围24.6±3.5cm,42.9%的患者存在饮食摄入障碍,37.1%的患者有胃肠道功能不适,25%的患者存在营养相关的损伤。4)MIS与透析时间、性别、Kt/V. Hb相关；CRP与白蛋白、血尿酸、MIS、 OSND相关。2、在既往研究的基础上,通过调整色谱柱的填料和孔径、流动相的条件,改变了Trp和Kyn的解离度和峰保留时间,得到一个比较合适的检测窗。将原方法色谱柱SymmetryaShieldRP-18column(150mmX3.9mm,id)换成色谱柱为Sinochrom ODS-BP C18柱(4.6mmX150mm,id,4.5μm);加大了流动相的酸碱度和乙腈的含量,最终流动相为15mmol/L乙酸钠-乙酸(含5%乙腈,PH4.8),流速1.0mL/min,紫外检测波长225mm,血浆标本经5%高氯酸溶液去除蛋白质后取上清液20μl直接进样分析测定。Kyn的保留时间为6.766min,线性范围为0.08-50μmol/L,最低检测浓度0.02μmol/L, Trp的保留时间为13.072min,线性范围为0.8-500μmol/L,最低检测浓度为0.2μmol/L, Kyn和Trp日内、日间测定的相对标准偏差均小于4%。结论1、营养不良是尿毒症患者预后的独立危险因素,MIS更适合中国人,营养不良在维持性血液患者普遍存在,需要定期评估,综合管理,及时干预；2、血浆中Kyn和Trp与MHD的营养状态及免疫功能均相关,而营养不良可导致免疫紊乱,本研究采用HPLC的方法,在借鉴既往研究的基础上,通过调整色谱柱的直径、流动相的PH值等方法,成功地在同一条件下同时检测到了MHD血浆内的Kyn和Trp的含量,该方法简便、快速、稳定,可应用于临床和科研工作。