研究背景牙周病是人类最常见的口腔感染性疾病,在世界范围内均有较高的患病率,在我国,牙周病的患病率高于发达国家,20世纪末,越来越多的临床和研究表明,牙周病与全身健康或疾病有着双向的密切关系,如近年来牙周炎被列为糖尿病的第六大并发症,牙周组织的炎症尤其牙周炎还被认为是某些全身疾病的危险因素。随着我国进入老龄化社会,牙周病,尤其是牙周炎将成为突出的保健问题,加之现行的牙周治疗方法无法使治疗后的牙槽骨吸收和牙龈退缩状况得到有效的改善,且牙周治疗后的疗效难以维持等问题存在,因此,通过组织工程的方法治疗牙周病成为牙周病研究的重点之一牙周膜干细胞(Periodontal ligament stem cells, PDLSCs)是存在于牙周组织中的干细胞,2004年施松涛等从牙周膜中首次分离出PDLSCs,其表现出间充质干细胞的一些特性,如多向分化潜能,克隆形成能力,明显的高增殖活性及表达公认的干细胞标志STRO-1、血管旁细胞标志CD146(这些标志在成牙骨质细胞、成骨细胞、牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞有同样的表达)和scleraxis(肌腱和韧带的特异性标志)；形态为成纤维细胞样,体外可分化为成脂细胞、成骨细胞样细胞、成牙骨质样细胞,体内可分化为成牙骨质样和牙周膜样组织。近年来的研究还发现,牙周膜干细胞还可分化为神经前体细胞。随着对牙周病发病机制的深入研究,现已较清楚的了解到,虽然微生物感染是引起牙周病的始动因素,而牙周病的大多数组织损伤却是由于宿主的免疫应答引起的,所以降低宿主的免疫应答可能会降低或减缓牙周病发展过程中的牙周组织损伤,促进牙周组织的再生。体内研究表明IL-1和TNF-α是牙周炎病理发生的关键分子,牙周炎症部位的龈沟液中IL-1和TNF-α浓度明显升高,而治疗成功后IL-1、TNF-α浓度则明显下降,说明牙周炎的严重程度与IL-1和TNF-α的浓度有关。在实验性牙周炎的原始模型中使用IL-1和TNF-α的拮抗剂可使移出牙槽骨的炎症细胞减少80%,骨丧失减少60%。所以降低牙周病中IL-1和TNF-α的浓度可降低牙周组织的损害,促进修复的进行。现行的牙周膜干细胞培养主要是运用常规贴壁培养来完成,用3D培养牙周膜干细胞的模式尚未见报道。侯延华等从第二前磨牙中成功地分离培养了牙髓干细胞(Dental pulp stem cells, DPSCs),并首次利用微载体在模拟微重力环境里进行了三维培养,培养后的细胞维持了DPSCs的干细胞特性,其最大密度较普通二维培养提高了11倍,证明了微载体和旋转细胞培养系统相结合的三维培养方法在牙齿组织工程学种子细胞的快速扩增方面具有可行性。现有研究表明,骨髓来源的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)具有免疫调节作用,且在组织中具有抗炎作用。MSCs可以调节淋巴细胞增殖从而抑制异常免疫反应。MSCs参与了B淋巴细胞和T淋巴细胞的发育。MSCs的作用是使免疫反应向抗炎或者免疫耐受方面倾斜,包括使Thl转化为Th2,减少B细胞分泌抗体量,下调NK细胞释放IFN-γ和抑制抗原递呈细胞增殖及其功能,其调节作用主要为抑制T细胞。MSCs在试管内能直接抑制αβ-T细胞和γδ-T细胞增殖,并且MSCs能逃避细胞毒T细胞介导的细胞溶解。MSCs还可以调节树突状细胞(dendritic cells, DC)分泌细胞因子的作用。Yanez等研究发现脂肪及骨髓来源的MSCs均能抑制骨髓源性DC和浆细胞源性DC的成熟,其中PGE2起主要作用。MSCs对同为自身免疫性疾病的类风湿性关节炎疗效在体内外实验研究中均有证实。还有研究表明静脉注射hMscs可提高心肌功能,减少心肌梗死的风险,因为hMscs可分泌TSG-6(TNF-α stimulated gene/protein, TSG-6), TSG-6可减少心脏的炎症反应和限制心肌组织的破坏。2010年Thomas J. Bartosh等将人骨髓间充质干细胞在体外用Hanging Drops的方法3D培养后发现,3D培养的MSCs可高表达TSG-6、STC-1等抗炎因子,其分泌量明显高于传统贴壁培养的人骨髓间充质干细胞。2008年,Yi Liu等用牙周膜干细胞在猪体内治疗牙周炎获得了一定的效果。综上所述,PDLSCs作为hMSCs的同源细胞,应该具备与hMSCs相似的特性,3D培养PDLSCs可能也同样能增加其矿化分化潜能及抗炎特性,若将3D培养的PDLSCs用于牙周病治疗,可能有利于降低牙周病发展过程中的炎症反应,降低宿主的免疫应答,从而减少其对牙周组织的损伤,促进牙周组织的恢复和重建,提高临床治疗牙周病的疗效,为探索新型牙周病的治疗方法提供实验依据。研究目的本研究通过3D培养PDLSCs增加其矿化分化潜能及抗炎特性,从而可能有利于降低牙周病发展过程中的免疫应答,减少自身免疫对牙周组织的损害,促进牙周组织的恢复和重建,提高临床治疗牙周病的疗效,为探索新型牙周病的治疗方法提供实验依据。材料与方法第一部分人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定本实验通过收集新鲜拔除的18-25岁无明显龋坏和牙周病的双尖牙或第三磨牙(经过本人及家属同意),用含双抗PBS溶液反复冲洗,刮取根中三分之一的牙周膜,用眼科剪将组织剪碎成约0.5mm×0.5mm×0.5mm大小,用Ⅰ型胶原酶(625U/mL)37℃消化组织块约10min,使组织松散,1000r/min离心5mmin,弃上清,加入少量培养液,轻轻吹打,使细胞悬液与松散组织呈混匀状态,然后移至6孔板内铺平,并加盖玻片压于组织之上,加入2m1培养液,放入37℃、5%C02培养箱培养。3d后半量换液,以后隔天换液,当细胞生长融合至80%时,传代培养。传代培养后,取第三代PDLSCs,分别接种于六孔板(2D培养)及根据文献的报道和预实验结果,按接种细胞数量不同分为三组,2.5x104组,5×104组、1×105组,将三组细胞分别接种至Perfecta3D Hanging Drop Plates3D培养板中,每天换液,96h后,收取2D细胞和3D细胞聚合物用流式细胞术检测其干细胞表面标记物CD44、CD29、CD90、CD105来鉴定细胞；将第三代PDLSCs按2.5×104/孔接种于24孔板中,2D细胞在24孔板培养96h后加入矿化诱导液DMEM(内含有10%FBS, O.1uM地塞米松,50uM维他命C,10Mmβ-磷酸甘油),2D PDLSCs矿化诱导7d后茜素红染色,倒置显微镜下观察；取第3代PDLSCs,以3×105／孔密度接种于6孔板中,待细胞生长密度达到80%后,更换为成脂诱导液(含10%血清的培养基加入1μM地塞米松,200μM消炎痛,0.5mMIBMX,10μg/mL胰岛素),置于37℃、5%CO2的培养箱中培养,隔3d换液。成脂诱导21d后,油红O混合液染色,倒置显微镜下观察脂滴的形成情况。第二部分2D培养和3D培养的牙周膜干细胞生物学特性的比较本实验通过肉眼及显微镜观察比较不同条件培养的牙周膜干细胞的生长差异(群体倍增时间、克隆形成)。对不同细胞量(2.5×104个/孔,5×104个/孔、1×105个/孔)的3D PDLSCs细胞聚合物行活性检测(live/dead染色),以筛选出最适合细胞浓度进行后续实验,应用茜素红染色及荧光定量PCR检测矿化结节形成情况以及矿化相关基因ALP和OPN表达。传代贴壁高密度的PDLSCs及不同细胞量(2.5×104个/孔,5×104个/孔、1×105个/孔)的3D PDLSCs分别培养72h后分别加入PI/Calcein-AM混合荧光染色液,PI的终浓度为15μmol/L, Calcein-AM的终浓度为10μmol/L。放入孵箱中孵育24h,荧光共聚焦显微镜观察。将第三代PDLSCs分别按2.5×104/孔接种于24孔板及hanging drop3D培养板中,2D细胞在24孔板培养96h后加入矿化诱导液DMEM(内含有10%FBS,0.1uM地塞米松,50uM维他命C,10Mm β-磷酸甘油),hanging drop3D培养板中2.5×104/孔的PDLSCs聚合物培养96h后,移入低粘附六孔板中,加入矿化诱导液,2D、3D PDLSCs分别矿化诱导7d后茜素红染色,倒置显微镜下观察。收集矿化诱导7d后2D和2.5×104/孔3D培养7d的PDLSCs,用Trizol提取总RNA,逆转录为cDNA,根据Genbank查得骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)和GAPDH的基因序列分别为NM000582.2、 NM001127501.2和NM002046.4,运用Oliga6.0软件设计特异性引物,上海生工生物工程有限公司合成引物。荧光定量PCR仪Mxpro-Mx7500检测比较2D、3D培养的PDLSCs矿化相关基因OPN及ALP RQ值的变化,并使用Mxpro-Mx7500自带软件对其结果进行分析。第三部分比较2D和3D培养方法培养的牙周膜干细胞分泌抗炎因子的差异收集2D和2.5×104/孔3D培养4d、7d的PDLSCs,用RNeasy Mini Kit提取总RNA,逆转录为cDNA,根据Genbank查得STC-1、TSG-6、TNF-α、IL-8以及GAPDH的基因序列,运用Oliga6.0软件设计特异性引物,上海生工生物工程有限公司合成引物。荧光定量PCR仪Mxpro-Mx7500检测比较2D、3D培养的PDLSCs炎症相关基因STC-1、TSG-6的表达情况,并使用Mxpro-Mx7500自带软件对其结果进行分析。分别收集2D、3D PDLSCs1d、2d、3d、4d的培养上清作ELISA检测,比较蛋白TSG-6、STC-1的分泌量的变化。结果1.成功分离培养鉴定2D及3D牙周膜干细胞改良酶消化组织块法培养7d后,细胞从组织块边缘游出,细胞呈长梭形,胞质均匀,胞体丰满,胞核呈椭圆形,胞质突起呈放射状,呈成纤维细胞样。所获细胞具有克隆形成能力,成骨、成脂能力。流式细胞术检测结果显示,第3代PDLSCs均表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD29、CD90、CD105,其阳性率分别为99.13%、98.17%、100%、78.21%。实验中细胞取材于人牙周膜组织,具有克隆形成能力及多向分化潜能,流式细胞术检测结果显示该细胞为间充质来源,因此,可认为该细胞为PDLSCs。PDLSCs3D培养96h后,PDLSCs形成一个均质的致密的3D细胞聚集体,细胞聚合物的致密程度与细胞初始接种数量呈正相关。细胞量为2.5×104/孔的细胞聚合物直径约为0.73±0.14mm,细胞量为5×104/孔的细胞聚合物直径约为0.94＋0.3mm,细胞量为1×105/孔的细胞聚合物直径约为1.24±0.23mm。流式细胞术对2.5×104/孔的3D细胞聚合物中的PDLSCs间充质干细胞表面标记物检测,结果显示CD44、CD29、CD90、CD105也均呈阳性表达,分别为99.58%、88.19%、99.51%、51.25%。2.2D培养和3D培养的牙周膜干细胞生物学特性的比较PDLSCs3D及2D培养96h后,3D PDLSCs聚合物及2D PDLSCs Live/Dead染色结果可见,3D培养细胞数量为2.5×104时,细胞存活率较高,未见明显的中心坏死现象；当细胞数量为5×104时,细胞存活率有所降低,但活细胞数目仍然较多；细胞数为1×105时,细胞存活率低,中心坏死明显,而2D培养PDLSCs未发现细胞坏死现象。2D和3D培养的PDLSCs矿化诱导7d后,常规贴壁培养的PDLSCs可见少量的红色矿化结节,而2.5x104/孔的PDLSCs的3D细胞聚合物,可见大量的茜素红阳性染色物质。荧光实时定量PCR结果显示,2D的PDLSCs、2.5×104/孔的3D PDLSCs聚合物矿化诱导培养7d后,2.5×104/孔的PDLSCs的3D细胞聚合物矿化相关基因ALP及OPN的表达的RQ值显著高于常规贴壁培养的PDLSCs(P<0.05)。3.比较2D和3D培养方法培养的牙周膜干细胞分泌抗炎因子的差异荧光实时定量PCR结果显示,2D的PDLSCs、2.5×104/孔的3D PDLSCs聚合物矿化诱导培养4d、7d后,2.5×104/孔的PDLSCs的3D细胞聚合物炎症相关基因STC-1、TSG-6表达显著高于常规贴壁培养的PDLSCs(P<0.05)。ELISA检测结果显示,培养1d、2d、3d、4d的2.5×104/孔的PDLSCs的3D细胞聚合物TSG-6、STC-1的分泌量均显著高于2D培养的PDLSCs(P<0.05)。结论1.应用HangingDrop96孔培养板3D培养的PDLSCs,当细胞接种数量为2.5×104/孔时,细胞聚合物中的细胞能保持较高的生存活性。PDLSCs经过悬滴法3D培养后依然可以保持间充质干细胞的表面标记物的阳性表达,并能显著促进其矿化分化的能力。2.3D培养PDLSCs可以显著增加抗炎因子STC-1、TSG-6的表达,并可以促进TSG-6及STC-1的分泌。