禽4型腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）是基因组长度为43-46 kb的线性双链DNA,比人腺病毒的基因组长8-10 kb。属共同基因编码病毒结构蛋白和参与病毒DNA复制,位于基因组中心,参与病毒-宿主相互作用的属特异性基因大多位于基因组的末端。FAdV的属特异性基因,除ORF1（d UTPase）、ORF8（GAM1）和ORF22外,其它属特异性基因功能还未被揭示。FAdV-4是鸡肝炎-心包积液综合征的主要病原体,自2015年7月以来,我国陆续报道了由新型FAdV-4基因型引起的HHS疫情,给家禽业造成了严重的经济损失。我们构建了新型FAdV-4的感染性克隆,并建立了基于FAdV-4的载体系统。在这里我们采用反向遗传学方法系统地研究属特异性基因对病毒复制的影响。研究基因组右侧非结构蛋白基因对病毒复制的影响,限制性核酸内切酶Hin d III、Eco RV、Xba I、Bsi WI、Eag I和Spe I可以将该区域分为5个片段,结合6个酶切位点中的2个可以构建一系列FAdV-4突变体,构建了XHE-CX19A、XEX-CX19A、XXB-CX19A、XBE-CX19A、XES-CX19A、XHB-CX19A共6株重组病毒。其中XHE-CX19A、XEX-CX19A、XXB-CX19A、XHB-CX19A在LMH细胞中可以正常复制增殖,通过一步生长曲线可以看出重组病毒与亲本病毒FAdV4-G FP均可以达到较高的滴度,其中2株重组病毒XEX-CX19A、XXB-CX19A甚至达到了1x108 IU/m L。病毒空斑实验表明删除Hind III-Eco RV片段减弱病毒复制,删除Eco RV-Xba I片段增强病毒复制,删除Xba I-Bsi WI片段没有明显影响病毒生长,即使同时删除Hind III-Bsi WI之间的3个片段,病毒仍可生长,只是病毒复制增殖能力又被进一步削弱。另外2株重组病毒XBE-CX19A、XES-CX19A转染后未见荧光聚集,或荧光聚集很小,随着培养时间的延长,这些荧光聚集没有增大,甚至没有消失。为了更准确地描述XBE-CX19A、XES-CX19A的活性,在转染3d和5 d收集分离的细胞,在7 d收集细胞和培养液,测定病毒滴度,最终结果表明从它们转染的LMH细胞中可以救回子代病毒,但病毒产量极低,难以维持子代病毒生长。研究特定ORFs对病毒复制增殖的影响,删除GAM1构建XGAM1-CX19A,在此基础上引入2个移码突变进一步阻止ORF22的表达构建X22G-CX19A,另外删除了ORF16和ORF17的编码序列,构建X1617-CX19A,3株重组病毒均可拯救成功并在LMH细胞中正常生长。通过病毒空斑实验可以看出XGAM1-CX19A增殖能力减弱,X22G-CX19A增殖能力进一步被削弱,这表明GAM1和ORF22对FAdV-4的生长具有协同作用,但两者都不是必需基因,而X1617-CX19A的增殖能力与亲本病毒相似。为了了解GAM1是否为重要基因,构建了辅助质粒p c DNA3-GAM1,结果表明添加辅助质粒转染后XBE-CX19A病毒滴度增加了35倍,而XES-CX19A病毒滴度则增加了260倍,对病毒的生长具有一定促进作用。启动子实验表明在ORF16-17、ORF28-29处具有启动子活性,流式实验也证明p KFA4RP-GC向右侧启动能力较强,启动活性为CMV启动子的48%,p KFA4RP2-GC向右侧启动活性为CMV启动子的7%,同时,两启动子向左侧转录的活性也被检测到,但是可忽略不计。由鸡胚实验可知,亲本病毒FAdV4-GFP在攻毒后第10天最初出现死亡,实验终点时死亡率达到100%,重组病毒XHE-CX19A与亲本病毒相比延迟3天死亡,死亡率为28.6%,此结果表明ORFF22和ORF20a的缺失会轻微影响病毒的毒力,而XGAM1-CX19A攻毒组鸡胚未发生死亡,表明GAM-1虽是病毒体外复制的非必需基因但其显著降低了在体内的复制水平。收集肝脏测定滴度,在XHE-CX19A组中,死亡鸡胚与存活鸡胚的病毒产量无明显差异。FAdV4-GFP组的平均病毒产量约为XHE-CX19A组的7倍,而XHE-CX19A组的病毒量约为XGA M1-CX19A组的4个数量级。通过FAdV4-GFP和FAdV4-CX19A的转录组实验可以看出在感染后8 h,GAM1的转录量超过200 TPM,在接下来的4 h内属特异性基因增长不到2倍,在18 h,GAM1有超过500个转录本,FAdV4-CX19A的转录类似,两病毒无明显差异。结果表明,FAdV-4是同时转录的属特异基因,未发现能特异控制其它基因转录的早期基因。综上,禽腺病毒血清4型的复制与属特异性基因有关,但没有一个基因是必需的。