卵透明带ZP是围绕在成熟的卵母细胞和排出的卵外围的一层细胞外糖蛋白基质。不同物种间，ZP的氨基酸组成具有较高的保守性。近年的研究表明，ZP家族蛋白成员在精子与卵的初级识别和结合过程中起着非常重要的作用。此外，ZP还参与诱发精子顶体反应，保护未着床前的胚胎和阻止多精受精等作用。由于ZP在精卵识别过程中的重要作用，很多研究者以ZP各组成蛋白为靶点进行了的免疫抗生育研究。我们前期工作表明：兔卵透明带ZPC羧基端部分序列具有免疫原性，可以激起接种动物较高滴度的抗体；实验动物的生育力与对照相比下降了60％。 为了进一步研究卵透明带ZPC在精卵识别过程中的功能片段及其作用机理，我们用RT-PCR、疫苗构建、细胞转染和免疫荧光、重组蛋白的原核表达、蛋白电泳和印迹、免疫组化、ELISA、动物接种及合笼生育等实验方法检测了选取的ZPC片段的免疫原性及抗生育效果。结果表明，无论以布氏田鼠还是兔ZPC片段作为靶点，接种动物都可以产生特异性的血清抗体，生育力都有不同程度降低。 布氏田鼠部分ZPC片段功能实验中，所选取的片段具有免疫原性。被接种动物产生了特异性抗体。血清抗体能够识别原核表达重组蛋白、真核表达重组蛋白；且能与卵巢原位(切片)的ZP直接结合。被接种动物的生育力下降了45％；形态学检测被免疫动物的卵巢结构未见明显损伤和病变。 联合接种实验中，以布氏出鼠部分ZPC片段和精子乳酸脱氢酶片段为靶点，分别构建成为基因疫苗，联合及单独接种，实验结果表明：联合接种后，动物体内能够同时产生针对两种免疫原的抗体；血清抗体能够与原核表达的重组蛋白结合；联合接种后动物的生育力与单独接种相比明显下降。 兔ZPC功能片段研究中，按ZPC外显子(exonsl-8)为单位，构建了四种基因疫苗。其中，包含外显子5-8的片段，其免疫原性较强，而且抗生育效果明显，对动物卵巢安全。ZP基元(exons3-6)免疫原性较差，而且对生育没有明显的影响。 综上所述，在精卵识别过程中，ZPC作为ZP家族的重要成员在受精过程中起着非常重要的作用；ZPC羧基端序列是功能片段，参与精卵识别与结合过程；当ZPC作为抗原接种动物时，具有较好的免疫原性，可以激起动物的特异性抗体；血清抗体可以识别特异性抗原，动物的生育力明显降低。 第二章布氏田鼠ZPC和LDHC4联合疫苗免疫抗生育研究 摘要 卵透明带ZPC和精子乳酸脱氢酶LDHC4分别在精卵识别和精子运动过程中起着重要的作用。通过RT-PCR的方法克隆了布氏田鼠的ZPC和LDHC4部分片段，成功构建了pCR3.1-brZPC’和pCR3.1-brLDHC4疫苗，两者分别能够在CHO细胞中表达ZPC和LDHC4蛋白。将两种疫苗以30μg的接种量单独及联合接种小鼠肌肉，小鼠能够激发特异性的体液免疫或者细胞免疫反应。抗体反应在westernblot实验中得到证实；细胞免疫反应在细胞因子检测中得到推测。而且，两种疫苗单独或联合接种时对小鼠的卵巢正常结构都没有明显的影响。实验结果表明两种疫苗单独或联合接种都能激发免疫反应，尤其是联合接种时既激发细胞免疫又激发体液免疫。联合接种可能具有更好的抗生育效果。 引言 哺乳动物的卵透明带(zonapellucida，ZP)是围绕在卵母细胞周围的细胞外基质，参与受精过程中精卵识别、黏附与结合。它还可以阻止多精受精，保护着床前的卵母细胞和胚胎(1)。在小鼠中，卵透明带按分子量大小主要分ZPA、ZPB、ZPC。研究证明，小鼠ZPCO-连接的寡糖被认为是初级精子受体，参与精卵结合的寡糖主要有α-Gal，β-GlcNAc，α-Fuc，α-Man和β-Gal等(1、2、3、4)，可以诱导顶体反应发生(5)；而ZPB主要参与精卵之间的次级结合。ZPA则可能保持整个卵透明带的完整性及在结构上稳定由ZPB和ZPC组成的二聚体(6)。鉴于ZPC在受精方面的重要作用，以ZPC为靶点的免疫避孕研究也大量展开。但是最初的研究中，以ZPC全长设计的蛋白疫苗常常使被免疫动物出现卵巢炎等自身免疫病(7)，而用ZPC多肽片段时，被免疫动物不孕并且卵巢结构正常(8)。 精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)特异性的存在于鸟类和哺乳类动物的睾丸和精子中，可以催化丙酮酸和乳酸的转化，为精子的运动和存活提供能量。在免疫学 第三章兔卵透明带蛋白免疫抗受精机理的研究 摘要 实验中，为了探讨兔ZPC蛋白不同外显子在精卵识别与结合过程中的作用，根据其cDNA序列，克隆了四段包含不同表位的片段，构建成为四种不同的基因疫苗。应用卵子免疫荧光、免疫组化、ELISA等分子生物学实验方法检测不同片段的免疫原性和和免疫抗受精的效果。得到的结果如下： 1.四种片段的免疫原性是不同的，除了ZP基元外，其它包含不同外显子的片段都具有免疫原性。 2.包含外显子5-8的片段或者连接于此的糖基位于卵透明带的外围，具有较好的免疫原性，明显的抗生育效果，而且对于卵巢的结构和功能是安全的。 3.ZP基元不具有免疫原性，而且它与精卵的识别和结合无关。 引言 哺乳动物的受精过程包括一系列的事件，使得精子与卵形成一个合子。精子与卵之间的识别与结合过程是非常重要和复杂的。在哺乳动物卵母细胞外包围着一种细胞外基质，称为卵透明带(zonapellucida，ZP)。ZP参与了精卵之间的识别与结合。具体说来，ZP的功能包括特异性识别，阻止多精受精和保护未着床前的卵母细胞和胚胎(1-3)。 在小鼠中，依据ZP的分子量，ZP可以分为ZPA，ZPB和ZPC三种糖蛋白。在这三种糖蛋白中，人们认为ZPC是初级精子受体；而ZPB被认为是次级精子受体(4)。小鼠中，ZPC的糖蛋白可能介导了鼠精子的结合(5-9)。这些糖基包括α-葡萄糖，β-葡萄糖胺，α-半乳糖，α-甘露糖和β-葡萄糖。在狨猴中进行的ZPC研究表明，被接种动物产生的抗体可以在体外抑制人类精子与ZP的结合(10)。本实验组以前的研究中，以布氏田鼠ZPC部分序列作为抗原进行抗生育实验，被接种小鼠的生育力下降了40％(11)。