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深色有隔内生真菌(Dark septateendophytes,DSEs)在全球范围内多种生境中广泛分布,尤其在重金属胁迫环境下自然恢复植物的根内其定殖极为丰富。项目组前期研究表明DSE能够增加Cd在宿主植物细胞壁中的富集,强化宿主植物细胞壁对重金属固持与区室化功能,从而提高宿主植物对重金属的耐性,但相关的作用机制却不清楚。本文以玉米B73为宿主植物,采用水培的方式,分别在有无Cd胁迫条件下接种和不接种DSE嗜鱼外瓶霉(ExophialapisciphilaH93),研究DSE对Cd在玉米根系不同组织、细胞和亚细胞水平上积累和分布的影响;同时,从DSE改变玉米根细胞壁结构组成和Cd吸附功能团的视角,探讨DSE强化Cd在宿主植物细胞壁富集的作用机制;并进一步从RNA水平上,系统地探讨DSE增强玉米重金属耐性的分子机制。论文取得的主要结果如下:1.通过测定玉米地上、地下部分Cd浓度,定量分析DSE对玉米Cd吸收、积累的影响。结果发现,无论是否有Cd胁迫,通过水培方式接种,E.pisciphilaH93均能在玉米根部成功定殖,且Cd胁迫显著提高了E.pisciphila H93在玉米根部的定殖率。与不接种的对照相比,E.pisciphila H93接种显著增加玉米根系Cd吸收、积累,而降低植物Cd的生物转移系数,显著提高玉米地上、地下部分的生物量。表明E.pisciphilE.H93通过强化玉米根系对毒性重金属离子的固持作用,提高宿主植物对Cd的耐受性。2.通过TEM-EDX(Transmission Electron Microscopy-Energy Dispersive X-ray Spectrometer)联用技术对玉米根组织不同部位细胞的Cd分布及含量进行原位表征,发现根系吸收的Cd颗粒主要在细胞壁上沉积。进一步的对比研究发现,较不接种的对照,E.pisciphila H93接种降低玉米根组织中木质部和韧皮部细胞的Cd含量,促进Cd在根表皮和皮层细胞的富集;这些结果提示着改变Cd在玉米根组织不同部位细胞中的分布和富集是E.pisciphila H93减轻Cd对玉米毒害的一种有效方式。3.对比研究不同处理条件下玉米细胞壁Cd固定及其不同组分固持力的评价,发现无论E.pisciphila H93接种与否,50%以上的Cd都固定在细胞壁中,说明细胞壁是玉米累积Cd的主要场所。但与不接种的对照相比,E.pisciphila H93接种显著提高玉米根细胞壁Cd固定的浓度和在根系Cd积累总量中的比例。进一步研究发现,玉米根细胞壁组分如果胶、半纤维素2等都具吸附Cd的能力,特别是半纤维素1和CW3(主要为纤维素、木质素和蛋白质)为Cd细胞壁吸附的最主要组分。而E.pisciphilaH93接种能够显著增加细胞壁果胶和半纤维1对Cd的富集,减少CW3中Cd含量的比例。结果表明E.pisciphilaH93通过提高玉米细胞壁,特别是果胶和半纤维素1对Cd的富集,从而提高宿主植物对Cd的耐受性。4.通过傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR)对玉米根细胞壁及不同组分中官能团进行分析,发现玉米根细胞壁各组分中羟基、氨基、酰胺基、酯基、羧基、多糖链、硫酸酯/磷酸盐等是吸附螯合镉离子的主要官能团,特别是E.pisciphia H93接种强化了宿主植物根细胞壁果胶中的多糖链、硫酸酯/磷酸盐以及半纤维素1中的轻基/氨基、羧酸盐、多糖链官能团的固持作用。5.通过细胞壁代谢相关酶活性及基因表达的分析,发现在Cd胁迫下,与不接种的对照相比,接种E.pisciphilaH93提高玉米根细胞壁合成相关通路的关键酶如PME(pectin methylesterase)、木葡聚糖内源糖基转移酶 XET(xyloglucan endotransglucosylase),POD(peroxidase)和漆酶(laccase)等基因的表达量,提高玉米根细胞壁相关酶的酶活性如果胶甲脂酶PME,苯丙氨酸解氨酶PAL(phenylalnineammonialyase)和过氧化物酶POD,改变了上述细胞壁组分和官能团的分布,从而强化E.pisciphila H93接种玉米的细胞壁Cd固定能力。6.通过RNA-Seq技术对玉米根组织的转录组进行比较分析,发现无论是否接种E.pisciphilE.H93,与无Cd胁迫相比,Cd胁迫均下调细胞壁合成代谢相关基因表达,如参与苯丙烷合成和苯基丙氨酸代谢的编码基因。但有意思的是,与不接种对照相比,接种E.pisciphilaH93缓解了由于Cd胁迫造成上述细胞壁的代谢过程,发现参与苯丙烷生物合成、苯基丙氨酸代谢、木葡聚糖代谢、半纤维素代谢、细胞壁多糖代谢等细胞壁代谢相关过程的基因显著上调表达。说明E.pisciphiE.H93参与调控玉米细胞壁代谢相关的途径是其增强玉米Cd耐性的重要机制之一。上述研究结果表明,无论接种E.pisciphila H93与否,细胞壁的固持与区室化功能是玉米耐受重金属Cd胁迫的主要机制。但与不接种的对照相比,接种E.pisciphila H93通过参与调控细胞壁合成相关通路基因的表达、调控,激活玉米细胞壁合成关键酶的活性,改变细胞壁组分和镉吸附配位官能团的分布,强化了细胞壁对根系所吸收的游离镉离子的固持与区室化作用,从而改变镉离子在玉米根系组织、细胞和亚细胞水平上的分布,进而限制其向原生质体和地上部分的运输,由此减轻Cd对玉米的毒害。因此,强化宿主根细胞壁的“库”积累是E.pisciphila H93提高玉米重金属耐性的主要机制之一。此外,RNA-seq结果还提示E.pisciphila H93对玉米碳代谢、氮代谢、氧化胁迫及抵御过程的调控可能在提高玉米Cd耐性中发挥重要作用,为我们下一步研究提供了线索。