飞蝗（Locusta migratoria L.）是一种农业重大害虫，分布面积广，为害严重。其中，东亚飞蝗（Locusta migratoria manilensis (Meyen)）是我国最重要的农业害虫之一，从温带到热带都有分布，常爆发式为害，并能远距离迁移。由于全球气候异常、旱涝频繁、农业生态环境变化和大量施用化学农药等多方面的因素，我国蝗害发生和成灾面积又有回升趋势。因此，加强对飞蝗的研究以及蝗灾的综合治理受到人们的高度关注。而且，飞蝗还是昆虫神经生物学、发育生物学和系统演化等方面研究的重要模式生物。近年来，在分子水平探索飞蝗的生命特征已逐渐成为热点，已经有大量的基因被克隆。因此，需要一种行之有效的方法来解读这些基因的功能。但蝗虫乃至整个直翅目昆虫缺乏有效的基因功能研究手段已成为制约这一领域继续向前发展的瓶颈。因此，建立蝗虫基因功能研究的技术体系已成为首要任务。 RNAi 即RNA 干扰是一种新的“基因敲除”技术，它通过人为地引入与内源靶基因具有同源序列的双链RNA，从而诱导内源靶基因的mRNA 降解，达到阻止基因表达的目的。由于RNAi技术特有的简单性、快速性、高效性和特异性，已经逐渐成为一项极具潜力的基因功能及创建“功能缺失”突变体的研究技术。尤其自parental RNAi方法在红粉甲Tribolium castaneum的成功建立为一些非模式昆虫的基因功能研究提供了一种行之有效的技术手段。 本研究采用parental RNAi方法来建立东亚飞蝗的基因功能研究技术体系，并用该方法研究东亚飞蝗hunchback基因的功能。现将主要研究内容和结果总结如下： ① hunchback基因的克隆 采用PCR、RT-PCR、RACE等方法克隆了东亚飞蝗的hunchback基因，得到hunchback基因的全长cDNA序列，并根据cDNA序列推导出氨基酸序列，分别登录到GenBank，登录号为DQ340870和ABC69039.1。东亚飞蝗hunchback基因cDNA全长3774bp，开放阅读框为5-2545，共编码846个氨基酸，推测蛋白分子量为92.09 kDa。Hunchback蛋白共有8个锌指因子：氮端2个（NF-1、NF-2）、中间4个（MF-1、MF-2、MF-3和MF-4）和碳端2个（CF-1、CF-2）。除此之外，还有A Box、C Box和Basic Box等结构域。 ② 东亚飞蝗parental RNAi 通过体外转录制备dsRNA，将dsRNA直接注射到东亚飞蝗雌成虫的血腔里。注射dsRNA后，所有的蝗虫都存活下来，一周后开始陆续产卵。与对照相比，注射dsRNA蝗虫的产卵量没有明显差异，说明dsRNA不影响蝗虫的生殖力。 采用ELISA的方法来检测产卵后42h的胚胎中Hunchback蛋白的相对含量，通过相对含量的变化来证实基因的沉默情况。同时，为了验证RNAi作用的特异性，选择组成性表达的β-tubulin作为内源基因对照。与对照相比注射dsRNA胚胎的Hunchback蛋白含量下降了将近4倍，而β-tubulin蛋白没有变化。说明RNAi特异性地抑制了内源靶基因的沉没，而没有对其他基因的表达产生影响。 产下的卵放在30℃保湿培养，发育到第6天或快孵化时，进行胚胎表型的分析。与发育正常的卵相比，RNAi的卵要稍微小一些。根据胚胎表型的严重程度，可以将hunchback基因沉默后的表型分为3类。 表型I：颌、胸部体节发育正常，腹部严重缩短，胸足畸形，占8.4％。 表型II：颌、胸部完全缺失，仅形成了前头部和一个缩短的腹部，占86.0％。前头部包括复眼、上唇和触角，由于大面积组织缺失，两个复眼长到了一起，形成典型的“V”形复眼。腹部仅形成了6-7个腹节，缺失了3-4个腹节。 表型III：颌部、胸部和腹部完全缺失，仅形成前头部，包括复眼、上唇和触角，占1.9％。 ③ RNAi作用的持续性 产下的第一个卵块几乎100％的都表现出RNAi表型，随后产下的卵块RNAi表型的比例逐渐下降，第5个卵块已经没有RNAi作用。说明RNAi的抑制作用是持续的但逐渐减弱的，东亚飞蝗RNAi的抑制作用能够持续19天左右。 ④ 东亚飞蝗RNAi的影响因素 剂量：本研究采用了20μg、2μg、0.2μg和0.02μg dsRNA/虫四个梯度，结果发现随着剂量的降低RNAi的作用迅速减弱，20μg和2μg dsRNA/虫几乎100％都产生RNAi表型，而0.02μg dsRNA/虫的剂量不能产生RNAi作用。说明dsRNA分子抑制hunchback基因具有剂量依赖性。 注射时间：本实验从第5龄末的若虫到羽化后第10天的成虫，均注射相同剂量的dsRNA（20μg dsRNA），每种处理至少做5个重复，结果仅第7天的成虫产生了RNAi作用。 不同长度dsRNA ：本研究中注射了3个长度分别为370 、533和1085 bp的dsRNA，结果处理之间没有显著差异。说明dsRNA的长度对RNAi的作用没有明显的影响。 ⑤ hunchback基因的功能 东亚飞蝗hunchback基因的parental RNAi产生了3种表型，其中表型II的颌部、胸部完全缺失，最严重的表型III仅形成了前头部，包括触角、复眼和上唇，其余部分全部缺失。表明东亚飞蝗hunchback基因在颌部和胸部区域起着典型的间隙基因的功能，调控颌、胸部体节的形成。 RNAi使腹部发育产生严重缺陷，表现为腹节缺失，仅形成6-7个腹节，或腹部仅形成一团紊乱的组织，没有形成明显的腹节。因此，hunchback基因不但是腹部伸长生长的需要，也是腹部分节所必须的调控基因。 ⑥ hunchback功能的进化 昆虫从短胚带向长胚带演化的过程中，hunchback基因的部分功能逐渐为其他基因所替代。因此，在低等昆虫中hunchback基因调控的体节数比高等昆虫的多。 Hunchback蛋白是含有锌指因子的转录因子，中间锌指因子（MF1-4）和碳端锌指因子（CF1-2）较为保守，从环节动物、线虫到节肢动物都有，而氮端锌指因子（NF1-2）则随着系统发育进化而逐渐丢失。随着系统发育，N. Vitripennis首先丢失了NF2，到高等的T. Castaneum和D. Melanogaster又丢失了NF1，只剩下MF1-4和CF1-2。低等昆虫的hunchback基因在体节模式形成中起着重要的功能，这可能与低等昆虫有NF有关。