【摘 要】
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由条形柄锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Eriks,Pst)引起的小麦条锈病,其病原菌是专一性的气传性真菌,有易传染、易突变等特点。不断有新的条锈菌小种出现,是造成小麦条锈病的大规模爆发,引起小麦产量的严重下降的重要原因。条锈菌侵染小麦是通过专一性的侵染器官——吸器完成的,它由吸器的细胞壁、细胞膜、寄主细胞的细胞膜形成颈型,使其成为一个封闭
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由条形柄锈菌(Puccinia striiformis Westend.f.sp.tritici Eriks,Pst)引起的小麦条锈病,其病原菌是专一性的气传性真菌,有易传染、易突变等特点。不断有新的条锈菌小种出现,是造成小麦条锈病的大规模爆发,引起小麦产量的严重下降的重要原因。条锈菌侵染小麦是通过专一性的侵染器官——吸器完成的,它由吸器的细胞壁、细胞膜、寄主细胞的细胞膜形成颈型,使其成为一个封闭的、寄主细胞非原生的结构。吸器通过向寄主细胞分泌效应蛋白,改变寄主的防御反应,从而向寄主吸收营养物质和能量,完成小麦的侵染过程。效应蛋白是病原菌产生的,能够改变宿主细胞结构和功能的小分子蛋白,它可以与寄主细胞的大分子发生相互作用,改变寄主细胞的防御反应,达到侵染的目的。小麦条锈菌效应蛋白Pst-1374来源于条锈菌美国小种PST-78夏孢子的cDNA文库,含有109个氨基酸,其中有6个半胱氨酸。在前期研究中,发现Pst-1374在本氏烟上的瞬时表达能够抑制BAX蛋白诱导的细胞坏死;Pst-1374也能抑制寄主的效应子触发免疫(Effector-Triggered Immunity,ETI)反应,表现在活性氧和坏死面积的减少。从条锈菌与小麦互作的非亲和的cDNA文库中用酵母双杂筛选、进一步用Pull down进行鉴定,发现Pst-1374与小麦叶绿体硫氧还蛋白TaTrxm能发生互作,也可以和自身互作。能和自身互作的结果,提示其可能是以多聚体的形式存在;其次Pst-1374富含半胱氨酸并且能和硫氧还蛋白互作,而硫氧还蛋白能解开二硫键。因此我们提出猜测:Pst-1374可能通过二硫键形成多聚体,TaTrxm通过打开二硫键使Pst-1374解聚成单体从而行使其功能。本研究利用原核表达体外纯化效应蛋白Pst-1374与靶标蛋白TaTrxm,使用生物化学与结构生物学的方法,如:凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography,GFC)、硫氧还蛋白活力测定、圆二色谱(Circular Dichroism,CD)、动态光散射(Dnamic Light Scattering,DLS)等技术测定Pst-1374与靶标蛋白TaTrxm的互作模式,实验结果如下:1.成功构建了Pst-1374和TaTrxm的原核表达载体;通过Ni柱和高效液相色谱对Pst-1374进行纯化;通过直链淀粉柱对TaTrxm进行纯化,得到电泳纯的蛋白。2.结构预测发现Pst-1374整体结构松散,只有小部分α-螺旋结构,大部分为无规则卷曲;通过圆二色谱实验发现Pst-1374的α-螺旋结构能被三氟乙醇(Trifluoroethanol,TFE)诱导产生,NaCl浓度能改变Pst-1374的二级结构组成;动态光散射实验发现Pst-1374在溶液中存在两种粒径分子。凝胶过滤层析实验证明Pst-1374是多聚体,二硫键参与多聚体的形成。3.TaTrxm的牛胰岛素实验证明了其具有硫氧还蛋白的活性;TaTrxm与Pst-1374反应实验证明了TaTrxm能通过打开二硫键解聚Pst-1374,证明Pst-1374通过与TaTrxm互作使多聚体打开行。通过上述实验结果,我们可以证明Pst-1374在溶液中通过二硫键形成多聚体,以多聚物的形式存在。TaTrxm与Pst-1374作用可以打开Pst-1374的二硫键,使多聚物发生解聚。这些实验的结果能够证明我们提出的“Pst-1374可能通过二硫键形成多聚体,TaTrxm通过打开二硫键使Pst-1374解聚成单体”的猜测,为后续研究Pst-1374如何改变宿主小麦防御机制提供思路。
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