食醋中乙偶姻转化及巴氏醋杆菌乙偶姻还原酶研究

来源 :中国石油大学(华东) | 被引量 : 0次 | 上传用户:andalee
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食醋是世界范围内的调味品,种类繁多,原料、制作工艺等不尽相同。乙偶姻是食醋中重要的风味活性物质之一,影响食醋风味。但是关于食醋中乙偶姻的来源与去路研究较少,分子机理尚不清楚。巴氏醋杆菌是食醋中一类重要的产酸细菌,巴氏醋杆菌中乙偶姻的转化目前尚无研究。另外,四甲基吡嗪(2,3,5,6-tetramethylpyrazine,TMP)是食醋中有助于身体健康的功能性化合物,但目前对食醋产品中TMP的形成机理还存在争议,对于如何提高食醋中TMP含量也缺乏文献报道。并且,目前尚不存在同时测定食醋中乙偶姻与TMP的气相色谱方法。因此本文主要研究内容包括以下四个方面。首先,建立了一个简单而准确的同时测定食醋中TMP和乙偶姻的气相色谱分析方法。TMP与乙偶姻的检出限分别为0.025 mg/L与1.36 mg/L,定量限分别为0.083 mg/L与4.53 mg/L,线性范围是从它们的定量限分别到236 mg/L和10,000 mg/L。乙偶姻的精密度(2.16%RSD)要高于TMP的精密度(6.28%RSD),方法的准确度用回收率表示,TMP与乙偶姻的回收率分别为101.94±1.96%与96.67±1.22%。与其它分析方法比较,该方法具有快速、经济、准确等优越性。其次,首次建立了TMP与乙偶姻、铵离子之间的Poly2D模型。将137种醋样分为Ⅰ组(51种山西固态发酵醋)、Ⅱ组(45种非山西固态发酵醋)、Ⅲ组(41种液态醋)。Ⅰ组比Ⅱ组Poly2D模型方程的R2值更大、校准组的均方根误差比预测组的均方根误差更低,所以Ⅰ组比Ⅱ组拟合效果更好。再次,通过同位素示踪法首次验证了食醋中TMP的前体为乙偶姻与铵离子。利用芽孢杆菌H18-W,以D-葡萄糖-1-13C为碳源制备13C标记的乙偶姻,将13C标记的乙偶姻与15N标记的NH4+作为示踪剂,GC-MS检测证明乙偶姻与铵离子为TMP的前体。对于指导实际的食醋生产、提高食醋品质具有重要意义。最后,研究了巴氏醋杆菌中新颖的乙偶姻还原酶。该蛋白由253个氨基酸组成,在序列上属于短链脱氢酶家族(SDR)家族,但却可以以(2R,3R)-2,3-BD为底物,该特征与中链的脱氢酶家族具有相似性。还原反应以乙偶姻与双乙酰为底物,依赖于NADH,双乙酰为最适底物,该底物的最适pH为9,最适温度为40℃;氧化反应以(2R,3R)-2,3-BD与meso-2,3-BD为底物,依赖于NAD+,(2R,3R)-2,3-BD为最适底物,该底物的最适pH为9,最适温度为50℃。与其他的乙偶姻还原酶相比,具有较低的Km值,能够催化双乙酰与(2R,3R)-2,3-BD转化为(3R)-乙偶姻,以及meso-2,3-BD与(3S)-乙偶姻相互转化。
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