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矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus)又名新疆沙冬青,与蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)同属豆科沙冬青属,是第三纪古地中海消失后的残遗物种。沙冬青对干旱、盐碱、贫瘠和极端温度等非生物逆境耐受性极强,是抗逆性极好且极珍贵的遗传资源。目前,关于沙冬青非生物逆境抗性基因的研究主要集中在蒙古沙冬青,鲜有关于矮沙冬青抗逆基因克隆及功能解析的报道。甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)是甜菜碱合成途径的关键酶,而甜菜碱是植物细胞中重要的渗透调节物质。钼辅助因子硫酸化酶(Molybdenum cofactor sulfurase,MCSU)催化钼辅助因子硫酸化,而硫酸化后的钼辅助因子则与脱落酸醛氧化酶一起在脱落酸(Abscisic acid,ABA)合成最后一步反应中催化脱落酸醛氧化生成ABA。磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)催化磷脂降解产生磷脂酸,在植物生长发育及逆境应答中起重要作用。液泡膜氢离子焦磷酸酶(Vacuolar H~+-pyrophosphatase,H~+-PPase或V-PPase)是液泡膜上的氢离子泵之一,水解焦磷酸盐产生势能,促进离子向液泡内转运。这4种酶参与不同生理代谢途径,与植物生长发育及逆境应答紧密相关。目前,已有关于其基因克隆、功能验证及转基因利用的报道,但尚未从抗逆性极强的矮沙冬青中克隆并研究其基因功能。为避免转基因抗逆品种培育方面的专利纠纷,本研究在前期用cDNA末端快速扩增技术从矮沙冬青中克隆得到AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1基因的基础上,综合运用实时定量PCR、原核表达、亚细胞定位、酵母或拟南芥突变体功能互补或过表达等技术,解析这4个基因的抗逆功能,以期为作物抗非生物逆境的转基因改良提供优异的基因资源。研究结果如下:(1)AnBADH基因cDNA序列全长1868 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)1512 bp,编码503个氨基酸,分子量54.71 kDa,等电点pH5.39,不稳定系数28.36,总平均亲水指数-0.015,具有一个BADH蛋白典型的磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖型醛脱氢酶超家族保守结构域,不具有跨膜区和信号肽。AnBADH基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱、高温、低温胁迫和ABA诱导。转AnBADH基因的大肠杆菌菌株,在高盐胁迫下的生长速度和高温胁迫下的存活率显著高于未转化对照。在高盐及干旱胁迫条件下,AnBADH基因在拟南芥中的异源表达显著促进根系发育,转基因株系相对含水量、甜菜碱及游离脯氨酸含量显著高于未转基因对照,相对电解质渗出率及丙二醛含量显著低于未转基因对照。(2)AnMCSU基因cDNA序列全长2544 bp,ORF长2289 bp,编码762个氨基酸,分子量84.85 kDa,等电点pH6.02,不稳定系数37.95,总平均亲水指数-0.255,具有MCSU蛋白典型的结构域,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnMCSU蛋白定位于细胞质。AnMCSU基因在矮沙冬青中的内源表达受高温、干旱、高盐及ABA诱导,受低温抑制,在拟南芥中异源表达促进种子发芽和根系发育。在高盐和低温胁迫条件下,转基因株系ABA含量和游离脯氨酸含量显著高于未转基因对照,表现较强的耐盐和抗冻性。(3)AnPLDα基因cDNA序列全长2832 bp,ORF长2427 bp,编码808个氨基酸,分子量91.58 kDa,等电点pH5.47,不稳定系数43.82,总平均亲水指数-0.418,具有PLDα蛋白典型的C2结构域和HKD基序,不具有跨膜区和信号肽。生物信息学预测和在烟草叶片中的瞬时表达检测表明,AnPLDα蛋白定位于细胞质。AnPLDα基因在矮沙冬青中的内源表达受干旱、高盐、低温及ABA诱导,受高温抑制,在拟南芥中的异源表达促进根系发育,在胁迫条件下抵制种子发芽。在高盐胁迫及ABA诱导条件下,转基因株系的丙二醛含量显著低于未转基因对照,表现较强的耐盐性,抗逆相关基因AtABI、AtNCED、AtRD29A、AtRD29B和AtADH的内源表达上调。(4)AnVP1基因cDNA序列全长2684 bp,ORF长2298 bp,编码765个氨基酸,分子量80.13 kDa,等电点pH5.46,不稳定系数23.02,总平均亲水指数0.631,具有5个V-PPase蛋白典型的保守结构域和13个跨膜区。AnVP1基因在矮沙冬青中的内源表达受高盐、干旱及ABA诱导,受高温和低温抑制,在酵母突变体中的异源表达可抑制其对高盐和渗透胁迫的敏感性,拟南芥中的异源表达促进根系发育。在高盐和干旱胁迫条件下,转基因株系Na~+/K~+离子、相对水和游离辅氨酸含量显著高于未转基因对照,丙二醛含量和相对电解质渗出率显著低于未转基因对照。上述结果表明,AnBADH、AnMCSU、AnPLDα和AnVP1四个基因在矮沙冬青非生物逆境抗性中起重要作用,在模式植物中的异源表达可显著增强其抗逆性,可用于作物抗逆转基因研究。