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第一部分细菌鞭毛钩蛋白FlgE诱导急性肺损伤的免疫机制目的:微生物成分与免疫系统的相互作用是病-宿互作的重要内容。但迄今为止,国内外对细菌鞭毛钩蛋白FlgE的免疫相关特性鲜有报道。课题组在之前研究中首次发现铜绿假单胞菌鞭毛钩蛋白FlgE具有显著的免疫调控功能,FlgE刺激HCEC和肺组织切片可活化多条与炎症、免疫反应相关的通路[1]。然而,FlgE作用机体后引起怎样的免疫效应仍不清楚。本部分以小鼠急性肺损伤模型为研究对象,阐述由FlgE刺激所引起的急性炎症的一般特点。方法:原核表达及纯化FlgE蛋白并去内毒素。FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺损伤模型。观察滴鼻后24 h小鼠肺部病变情况。流式分析肺组织中浸润的免疫细胞的亚群及比例,同时检测脾脏中免疫细胞的变化。q-PCR检测肺组织中炎症因子的基因表达水平。ELISA检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF,Bronchoalveolar lavage fluid)中细胞因子的表达水平。荧光显微镜观察肺组织NETs产生情况,并用DNA定量试剂盒检测BALF中游离DNA的含量。另外,前期实验初步证实肺上皮细胞膜表面表达的CAV1(Caveolin-1)蛋白为FlgE的可能配体之一[1],本实验中分离CAV1基因敲除(Caveolin-1-/-)小鼠骨髓来源的中性粒细胞并给予FlgE刺激,q PCR检测炎症因子的表达。结果:成功制备去内毒素的FlgE蛋白。FlgE滴鼻24 h后成功建立小鼠急性肺损伤模型。在FlgE诱导的急性肺损伤中,浸润的免疫细胞主要是中性粒细胞,免疫消除中性粒细胞后炎症减轻。FlgE刺激后小鼠肺组织和BALF中细胞因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、IL-23、G-CSF)和中性粒细胞趋化因子(如CXCL1、CXCL2和CXCL5)的表达显著升高。FlgE刺激后ROS+中性粒细胞比例升高,而中性粒细胞凋亡不明显。此外,荧光显微镜下可见FlgE滴鼻后小鼠肺组织中有NETs样结构存在,同时BALF中DNA含量显著升高。然而,体外抑制中性粒细胞内ROS的产生并不能阻断其NETs的释放。此外,q PCR结果显示,CAV1基因缺失可显著降低FlgE刺激引起的中性粒细胞内炎症因子(如IL-1b、IL-6、IL-17A、CXCL1、CXCL2)的表达。结论:FlgE刺激小鼠引起炎症反应,其主要效应细胞是中性粒细胞。迁移到炎症部位的中性粒细胞以NETs形式发挥作用。此外,中性粒细胞膜表面CAV1蛋白可能为FlgE的结合分子之一。第二部分IL-17A在细菌鞭毛钩蛋白FlgE致炎活性中的作用目的:IL-17A是调节机体炎症反应的一个关键细胞因子,由多种细胞分泌。初步研究发现在FlgE滴鼻建立的小鼠急性肺炎模型中IL-17A的基因和蛋白表达水平均升高。因此本部着重探讨IL-17A的缺失对FlgE引起的急性炎症的影响。方法:应用野生型(WT,wild-type)小鼠和IL-17A基因敲除(Il17a-/-)小鼠,FlgE(250mg/100mL)滴鼻建立小鼠急性肺损伤模型,滴鼻24 h后处死小鼠收样检测。从组织症病变程度、免疫细胞细胞浸润水平以及细胞因子表达及分泌三个方面比较IL-17A缺失对的FlgE引起的急性肺炎的影响。分离WT小鼠和Il17a-/-小鼠的肺组织,给予FlgE刺激,建立体外培养模型[1],western blot检测FlgE刺激不同时间点肺组织中STAT3的磷酸化水平,transwell迁移实验比较FlgE刺激后两种小鼠肺-组织培养上清对中性粒细胞迁移和NETs形成的影响。Percoll密度梯度离心法分离野生型小鼠骨髓来源中性粒细胞,采用flow cyto、q PCR、western blot等方法检测中性粒细胞在FlgE刺激下后其自身IL-17A的表达和STAT3的磷酸化水平。结果:与WT小鼠相比,FlgE滴鼻后Il17a-/-小鼠肺组织炎性病变及免疫细胞浸润程度均明显减低,而预先免疫消除中性粒细胞后,FlgE引起的炎症反应程度在两种小鼠中均减弱。当IL-17A缺失后,除IL-23无明显差异外,来源于肺组织和BALF的细胞因子(如IL-1b、IL-6、G-CSF)和趋化因子(如CXCL1、CXCL2)的基因表达和蛋白分泌水平均显著降低。western blot检测FlgE刺激相同时间时肺组织切片中STAT3的磷酸化水平,发现,Il17a-/-小鼠肺组织切片中STAT3的活化水平低于WT小鼠肺片的活化水平。尽管用FlgE与野生型小鼠或Il17a-/-小鼠的肺片共培养上清(刺激时间24 h)做趋化剂都可以显著增加中性粒细胞迁移的数目,然而,当IL-17A缺失后此种趋化效应明显低于正常小鼠的趋化效应。另外,肺片经STAT3抑制剂预处理后其共培养上清趋化引起的中性粒细胞迁移数量减少。骨髓来源中性粒细胞在FlgE(5mg/m L、10mg/m L)刺激作用下IL-17A-IL-17RC的基因表达水平升高、STAT3的磷酸化程度增加。激光共聚焦显微镜下可见大量中性粒细胞核呈弥散网状结构(NETs,neutrophil extracellular trap)附着于WT小鼠的肺组织,同时BALF中游离DNA含量以及血清中MPO含量均明显升高,而IL-17A缺失后中性粒细胞核多呈典型分叶结构且DNA和MPO检出量亦远低于WT小鼠的含量。FlgE与WT小鼠肺组织共培养上清亦可引起明显的NETs释放现象,而IL-17A缺失后此种效应减弱。另外,FlgE单独刺激中性粒细胞可引起NETs释放,而IL-17A单独作用并不能引起NETs的产生。结论:在FlgE引起的急性肺损伤中,IL-17A通过肺组织促进趋化因子(如CXCL1、CXCL2)的表达进而募集中性粒细胞至炎症部位,此过程受STAT3的调节。侵润的中性粒细胞产生NETs释放。FlgE可直接刺激中性粒细胞表达IL-17A、上调STAT3的磷酸化水平。第三部分细胞膜表面ATP5B介导FlgE对血管内皮细胞的调节功能目的:虽然绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE免疫调控功能已得到证实,且此免疫活性可能由两个关键肽段Be位点和Fe位点介导[1],然而细胞表面与其结合的分子并不清楚。课题组应用亲和Pull-down技术,初步发现FlgE可与CAV1、ATP synthase、Rab5等细胞膜分子结合[1],然而,缺乏有力的实验数据证明这一推测。近年研究发现细胞膜表面表达的ATP合酶在能量代谢、炎症反应及肿瘤免疫等发面发挥重要作用。本实验以HUVEC和SVEC细胞系为模型,探讨其表面的ATP5B在FlgE识别及调节血管内皮细胞生物学功能中的作用。方法:制备ATP5B蛋白的兔源性多克隆抗体(Pc ATP5BAb)流式检测HUVEC和SVEC细胞膜表面ATP5B蛋白的表达。提取内皮细胞(ECs)胞膜蛋白,采用亲和Pull-down技术检测FlgE和FlgEM与ATP5B蛋白的结合。流式及ELISA法检测FlgE、FlgEM、B肽段、F肽段与内皮细胞膜表面ATP5B蛋白或重组ATP5B蛋白的结合,Luminescence法检测此过程中ECs表面ATP合酶活性的变化情况。通过细胞增殖(MTT法)、细胞迁移(细胞划痕实验)、细胞凋亡(Annexin V-7AAD)、细胞通透性(FITC-Dextran)等实验检测FlgE的刺激活性及细胞膜表面ATP5B蛋白经抗体、B肽段或F肽段阻断后对FlgE刺激活性的影响。q PCR和western blot方法检测相关基因或蛋白的变化。结果:流式方法检测到HUVEC和SVEC细胞膜表面有ATP5B蛋白的表达,且ATP5B蛋白表达量与细胞的增值状态相关。Pull-down结果可见FlgE,而不是FlgEM,与ECs细胞膜ATP5B蛋白结合。流式与ELISA检测发现虽然FlgEM亦可与ECs结合但其结合能力远远低于FlgEM、Be短肽及Fe短肽,且后三者与ecto-ATP5B的结合可被Pc ATP5BAb特异性抑制。Be短肽及Fe短肽与重组ATP5B蛋白或ECs表面ATP5B蛋白的结合可被FlgE或Pc ATP5BAb竞争性抑制。此外,Be短肽和Fe短肽还具有与Pc ATP5BAb相似的功能,与ECs细胞膜表面ATP5B亚基结合后能抑制其催化ADP转化为ATP的活性,有趣的是,FlgE和FlgEM对ATP合酶活性影响不大。FlgE刺激可引起HUVEC和SVEC增殖减弱、迁移增加、凋亡增加、通透性增强等现象,而当HUVEC和SVEC细胞经Pc ATP5BAb封闭后可显著减弱FlgE刺激引起的以上效应。结论:重组FlgE蛋白通过Be和Fe位点与内皮细胞膜表面的ATP5B蛋白结合从而介导内皮细胞的一系列炎性改变。